副溶血性弧菌Vop T蛋白的表达及其抗体的毒力菌株特异性研究

杨振泉，饶胜其，高 璐，薛 峰，李 平，方维明，焦新安

副溶血性弧菌Vop T蛋白的表达及其抗体的毒力菌株特异性研究

杨振泉1,3，饶胜其1，高 璐1，薛 峰2，李 平1，方维明1，焦新安3

目的 研究副溶血性弧菌VopT蛋白的菌群特异性，为建立致病性副溶血性弧菌的快速检测方法以及探讨VopT的作用机制奠定基础。方法 根据副溶血性弧菌VopT蛋白基因(VPA1327)序列设计合成引物，通过PCR从副溶血性弧菌致病株WX06152(血清型O3∶K6)中扩增出目的基因，构建原核表达载体pET-30a(+)-VPA1327并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达，重组蛋白应用MALDI-TOF-MS/MS鉴定和His镍柱纯化，并通过免疫BALB/c小鼠制备抗血清，建立副溶血性弧菌VopT蛋白的间接ELISA检测方法，并分析其敏感性和毒力菌株特异性。结果 成功表达了大小为33 kDa融合蛋白，肽指纹图谱与副溶血性弧菌VopT蛋白一致。重组VopT抗血清能够特异性检测副溶血性弧菌毒力株的全菌细胞及其裂解蛋白，与环境株及其它种属菌株无明显交叉反应，灵敏度达到105CFU·mL-1。结论 重组VopT的抗血清具有良好特异性，为探讨VopT致病机理和分泌机制研究提供了一定的参考依据。

副溶血性弧菌；VopT蛋白；原核表达；多克隆抗体；特异性

Supported by the Jiangsu Province Science and Technology Support Program (No. BE2013733) and the North Jiangsu Science and Technology Development Project (No. BC2013438)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)广泛分布于海水环境和海产品中，流行病学研究显示Vp引起的食源性疾病呈世界性分布，目前已经成为沿海国家和地区面临的重要公共卫生问题之一[1]。研究表明95%以上的环境分离株不具有致病性[2]，尽管耐热性直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin，TDH)以及耐热相关溶血毒素(Thermostable Related Hemolysin，TRH)被公认的致病性副溶血性弧菌主要的毒力标志物，基于这两个蛋白及其编码基因(tdh和trh)的生化及分子方法已被用于副溶血性弧菌毒力株的体外检测，但是近年来流行病学调查发现副溶血弧菌的临床分离菌株中存在少数不含有tdh和trh基因，显示了流行株还存在新的分子特征的菌群[3]。

VopT是一种具有ADP-核糖基转移酶活性的效应蛋白[4]，它的编码基因(VPA1327)位于副溶血性弧菌染色体Ⅱ的毒力岛上。这种蛋白与绿脓假单胞菌T3SS分泌的双功能细胞毒素ExoT和ExoS的ADPRT结构域分别具有45%和44%的同源性，并且VopT基因敲除能够使副溶血性弧菌毒力株的细胞毒性显著减弱，显示该基因与菌株致病性具有密切关系[5]。另一方面，VPA1327基因片段显示了良好的毒力菌株特异性，是副溶血性弧菌毒力菌株检测的潜在分子靶标[6]，但其编码产物VopT的作用机制、菌群特异性及其在致病菌株快速检测中的应用仍有待深入研究。本研究对副溶血性弧菌大流行株Vop T的编码基因VPA1327进行表达和多克隆抗体制备，建立了副溶血性弧菌VopT的ELISA检测方法，并验证了Vop T的毒力菌株特异性，为进一步探讨VopT的作用机制提供了新参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 副溶血弧菌WX06152(tdh阳性，血清型O3∶K6)为扬州大学食品微生物实验室保藏；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)以及表达载体pET-30a(+)为扬州大学江苏省人兽共患病重点实验室保存；限制性内切酶BamHI和Xhol、T4 DNA 连接酶、Taq酶、dNTPs、DNA Marker、PCR产物纯化试剂盒、UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生物工程股份有限公司；BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心；酵母浸出粉、胰蛋白胨、IPTG等生化试剂购自北京奥博星生物技术开发有限责任公司，所有化学试剂均为国产分析纯。引物合成及基因测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 表达载体构建 副溶血弧菌基因组DNA的提取参考文献[7]所述方法进行。依据GenBank中副溶血弧菌VPA1327基因序列和表达质粒pET-30a (+)上的多克隆位点设计引物，上游引物VPA1327-F (P1) 为5′-GAAGGATCCGTGAAGGTTTGTAGAATACA-3′，5′端添加BamHI酶切位点；下游引物VPA1327-R (P2)为5′-GAACTCGAGTCACTTAGCTAAATCTAGCG-3′，5′端添加Xhol酶切位点。25 μLPCR扩增体系为：模板(50 μg/mL)1 μL； dNTP(10 mmol/mL)0.5 μL；上游引物 (50 pmol/ μL)0.5 μL；下游引物(50 pmol/ μL)0.5 μL；10×Buffer 2.5 μL；MgCl2(2 mmol/L)2 μL；Taq酶(5 U/μL)0.5 μL；ddH2O 17.5 μL；PCR反应的循环参数为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 cycles，72 ℃再延伸10 min。

采用常规分子克隆技术，将VPA1327基因的PCR扩增产物与表达载体pET-30a(+)分别进行BamHI和Xhol双酶切，胶回收目的片段及酶切后的表达载体，采用T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜，转化感受态细胞E.coliBL21，于Km+(100 μg/mL)平板上筛选重组子。提取质粒后，采用PCR、双酶切以及测序鉴定阳性克隆，并用DNAstar软件对测序结果和GenBank中所报道的序列进行比对分析。

1.3 诱导表达及表达产物鉴定 将鉴定结果为阳性的重组质粒pET-30a(+)-VPA1327转化到E.coliBL21(DE3)中。挑取上述阳性克隆接种于5 mL LB(Km+)液体培养基中37 ℃活化过夜，次日以1%接种量接入新鲜的LB( Km+)液体培养基中，37 ℃，200 r/min振荡培养至OD600 nm为0.5时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，37 ℃，诱导培养4 h。诱导结束后，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，用PBS重悬沉淀后进行SDS-PAGE电泳分析，同时以宿主菌DE3诱导前、pET-30a(+)/DE3诱导前后以及pET-30a(+)-VPA1327/DE3诱导前的全菌体作为对照。

表达产物的鉴定应用MALDI-TOF-MS/MS进行分析，酶解方法：Trypsin酶解；质谱参数：ABI 4800 MALDI-TOF质谱仪；YAG激光源，波长355 nm，频率200 Hz；采用阳离子工作反射模式进行MS/MS检测，离子加速电压为20 kv；使用标准肽混合物(Angiotensin II Mr1046.5420； Angiotensin I Mr1296.6853；Substance P Mr1347.7361；Bombesin Mr1619.8230； ACTH clip 1-17 Mr2093.0868；ACTH clip 18-39 Mr2465.1990；Somatostatin 28 Mr3147.4714)作为外标校正。

1.4 重组蛋白纯化 对于成功表达出重组蛋白的 BL21(DE3)按 1%比例接种后扩大培养，IPTG诱导重组蛋白表达，4 ℃离心收集细胞并洗涤后，冰浴超声裂解细胞，4 ℃，10 000 r/min离心20 min，收集包涵体并用1% Triton X-100洗涤后，用变性液(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0，8 mol/L尿素，5%甘油)溶解，接着用变性液平衡过的Ni-NTA柱进行亲和层析，先用含50 mmol/L 咪唑的变性液充分洗去杂蛋白后，再用含300 mmol/L咪唑的变性液洗脱目标融合蛋白。将Ni-NTA柱纯化后收集的目标蛋白溶液装入透析袋(截留分子量10 kDa)，放入复性缓冲液中，于4 ℃磁力搅拌(转速150 r/min)，进行尿素浓度梯度透析。透析复性液为：25 mmol/L Tris-HCl (pH 7.3)，0.15 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1.5 mmol/L GSH，0.3 mmol/L GSSG，5%甘油，0～6 mol/L尿素。每隔8 h换一缓冲液，依次为含6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L与0 mol/L尿素的复性液，最后对含0.9% NaCl的生理盐水(pH 7.3)进行透析。用SDS-PAGE分析纯化复性后的目标蛋白，并用灰度扫描软件分析蛋白纯度。

1.5 多克隆抗体制备 取10只6周龄的BALB/c小鼠，将表达蛋白产物用PBS稀释成3 mg/mL，首次免疫将蛋白与弗氏完全佐剂以1∶1的体积比混合，充分乳化后，每只小鼠经腹部皮下注射400 μL；分别于首次免疫后的第3和第5周进行加强免疫, 每次用3 mg/mL表达蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化后，对小鼠进行腹部皮下注射，每只小鼠经腹部皮下注射400 μL。取2只BALB/c小鼠以PBS和弗氏完全佐剂混合作为抗原免疫，作为阴性对照，免疫程序同上。第3次免疫后第10 d眼眶采血，分离血清，于-20 ℃保存备用。抗血清的效价采用间接ELISA方法检测，分别以经超声处理(200 W，持续10 s，间隔5 s，共10次)的副溶血弧菌裂解蛋白和重组蛋白为抗原包被酶标板，以未经免疫的鼠血清作为阴性对照，根据反应结果确定抗体的效价。

1.6 抗血清反应性和敏感性试验 抗血清对副溶血性弧菌的反应性和敏感性的通过间接ELISA方法检测。包被抗原采用菌株WX06152的细胞、细胞裂解蛋白以及培养物上清。将副溶血弧菌WX06152于37 ℃，150 r/min培养3 h、6 h、9 h和12 h，培养物通过离心分离菌体和培养上清。菌体经过3次洗涤后用PBS制备成108CFU·mL-1的菌悬液。细胞裂解蛋白通过菌悬液超声处理(200 W，持续10 s，间隔5 s，共10次)后离心收集。将上述组分用PBS缓冲液10倍稀释后为抗原包被酶标板，每样设3个平行孔，以1∶400、1∶800和1∶1 600稀释的抗血清作为检测抗体，1∶10 000稀释的HRP酶标羊抗鼠IgG作为二抗，按照间接ELISA程序进行反应，OPD显色后测定OD492值。阴性对照为同样稀释度的阴性血清。阳性血清和阴性血清的比值(P/N)最大的组合作为最佳抗原和抗体的工作浓度，P/N≥2.1判定为阳性。

1.7 抗血清交叉反应试验 将6株不同来源的副溶血弧菌菌株、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌于37 ℃，150 r/min培养12 h，离心收集的菌体细胞，制备106CFU·mL-1的菌悬液，通过超声处理(参数同1.7)制备菌体蛋白作为包被抗原，以1∶800稀释的抗血清作为检测抗体，1∶10 000稀释的HRP酶标羊抗鼠IgG作为二抗，同样稀释度的阴性血清为对照，建立间接ELISA检测方法。通过比较P/N值检测抗血清是否具有交叉反应，P/N≥2.1判定为阳性。

2 结 果

2.1 目的基因PCR扩增和表达载体构建结果 根据VopT编码基因VPA1327序列设计引物VPA1327-F和VPA1327-R，建立优化的PCR体系扩增目的基因，并克隆至表达载体pET-30a(+)的多克隆位点中，结果如图1所示。结果成功从副溶血性弧菌WX06152株(血清型O3∶K6)基因组DNA中扩增出目的基因片段，片段大小为711 bp，与预期值相符(泳道4)。构建重组质粒pET-30a(+)-VPA1327经BamHI和Xhol双酶切消化后出现两条条带，一条与经双酶切的空质粒pET-30a(+)大小一致(泳道2)，另一条带分子量为711 bp，与预期大小一致(泳道1)。重组质粒能够扩增出目的条带(泳道3)，大小与基因组模板扩增产物大小一致(泳道4)，而以空质粒模板未扩增出任何条带(泳道5)。重组质粒进一步应用T7通用引物测序，结果显示，克隆序列与GenBank中发表的VPA1327序列同源性达100%，且基因没有发生移码和突变。以上结果表明目的基因VPA1327已成功克隆入表达载体pET-30a(+)中。

泳道M，DNA分子量标准；泳道1和2，重组质粒和空质粒的酶切产物；泳道3、4和5，重组质粒、基因组DNA以及空质粒的PCR扩增产物；箭头方向为目的基因条带(711 bp)。

Lane M: DNA ladder; Lane 1 and 2: enzyme-digested products of recombinant and empty plasmid; Lane 3, 4 and 5: PCR amplicons of recombinant plasmid, genomic DNA and empty plasmid; Arrow means aim gene band (711 bp).

图1 VopT基因的PCR扩增及表达载体构建结果

Fig.1 Results of PCR amplification of VopT gene and construction of expression plasmid

2.2 重组蛋白的诱导表达与纯化结果 将重组质粒pET-30a(+)-VPA1327转化宿主菌E.coliBL21(DE3)，通过抗性筛选和PCR鉴定成功获得了重组表达菌pET-30a(+)-VPA1327/DE3。通过IPTG诱导表达后的菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2-A所示。重组菌pET-30a(+)-VPA1327/DE3经IPTG诱导培养后在33 kDa处有一条新增蛋白条带，与预期的融合蛋白分子量大小一致(泳道5)。宿主菌E.coliBL21(DE3)及空质粒载体转化菌诱导前后，以及未经IPTG诱导的pET-30a(+)-VPA1327/DE3均没有产生目的条带。结果表明VPA1327在E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导后能成功表达融合蛋白。诱导后的pET-30a(+)-VPA1327/DE3全菌体经超声处理后的沉淀和上清分别进行SDS-PAGE电泳分析(图2-A，泳道6和7)，结果显示培养上清中不存在重组蛋白，诱导表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在于菌体沉淀中。表达产物包涵体经变性液溶解、His镍柱纯化及尿素浓度梯度透析后取样用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，在33 kDa处出现清晰条带, 其他蛋白杂带不明显(图2-B) , 经灰度扫描分析蛋白纯度大于90%。

2.3 重组蛋白质MALDI-TOF-MS质谱鉴定 重组蛋白质进行割胶回收、脱色和胶内Trypsin酶解，产物应用MALDI-TOF-MS质谱分析，获得的肽片段质量数据通过蛋白质数据库Mascot(http://www.matrixscience.com)进行检索，结果显示重组蛋白与库中副溶血性弧菌推测胞外酶VopT序列(VPA1327的编码产物)的PMF匹配得分最高，达到263，VopT序列相匹配的肽段覆盖率达61%(图3)，显示表达产物的氨基酸序列与副溶血性弧菌VopT蛋白一致。

(A)泳道M，蛋白标样；泳道1，DE3未诱导细胞；泳道2，pET-30a(+)/DE3未诱导细胞；泳道3，pET-30a(+)/DE3诱导后细胞；泳道4，pET-30a(+)-VPA1327/DE3未诱导细胞；泳道5、6和7分别pET-30a(+)-VPA1327/DE3诱导后全细胞超声破碎原液、沉淀和上清；(B)泳道M，蛋白标样；泳道1，纯化后蛋白样

(A) Lane M: molecular marker; Lane 1: DE3 cell without being induced; Lane 2: pET-30a(+)/DE3 cell without being induced; Lane 3: induced pET-30a(+)/DE3 cell; Lane 4: pET-30a(+)-VPA1327/DE3 cell without being induced; Lane 5, 6 and 7: culture, cell and supernant of induced pET-30a(+)-VPA1327/DE3.(B) Lane M: molecular marker; Lane 1: purified recombinant product.

图2 重组蛋白的表达(A)与纯化(B)电泳结果

Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression (A) and purification (B) of recombinant protein

2.4 抗血清反应性和敏感性试验结果 将纯化的VPA1327表达产物免疫6周龄的BALB/c小鼠，加强免疫后眼眶采血并分离抗血清，以阴性血清作为对照，经间接ELISA法检测抗血清对重组蛋白的效价为1∶25 600。以1∶800稀释的抗血清作为检测抗体，建立ELISA法对过夜培养的副溶血性弧菌的全细胞、细胞裂解蛋白以及培养上清的反应性和敏感性进行测定，结果如表1所示。结果显示抗原的细胞浓度大于105CFU·mL-1时，全菌包被和超声波裂解产物包被均检测为阳性(P/N>2.1), 但是以培养上清包被的各个稀释度均没有检出阳性。

2.5 细菌培养时间对检测的影 利用不同培养时间(3 h、6 h、9 h和12 h)的副溶血弧菌WX06152的全细胞、细胞超声裂解物以及培养物上清液作为抗原包被酶标板，按照建立的ELISA方法检测Vop T，检测结果如图4所示。结果显示3 h和6 h培养物的全细胞、细胞裂解物以及培养物上清液中均未检出Vop T(P/N<2.1)，但在培养9h的全细胞和细胞裂解物中Vop T呈明显阳性(P/N值分别为6.67±2.33和8.53±4.15)，之后随着培养时间的延长P/N值有所上升但不显著(P>0.05)，12 h 培养物的全细胞和细胞裂解物的P/N值分别为7.54±3.12和9.06±4.38；而3～12 h培养物上清液作为包被抗原时，Vop T始终为阴性(P/N<2.1)。结果表明副溶血弧菌在生长过程中(3～12 h)，Vop T在生长后期表达并主要存在于细胞内或者膜表面，分泌到胞外的VopT及其微量，无法通过ELISA检测出。因此，选择培养时间9 h后的副溶血性弧菌细胞，经过超声处理形成的裂解物后作为最佳检测抗原。

2.6 抗血清交叉反应试验结果 以不同来源的副溶血弧菌菌株以及溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的细胞裂解物(106CFU·mL-1)作为包被抗原，检测抗血清的特异性，结果(如表2所示)显示只有副溶血性弧菌临床株检测结果呈阳性(P/N>2.1)，其余细菌均呈阴性(P/N<2.1)，表明副溶血性弧菌VopT蛋白具有良好的毒力菌株特异性。

注：A原液为108CFU·mL-1菌悬液;B原液为起始浓度为108CFU·mL-1菌悬液裂解产物；C原液为副溶血性弧菌12h培养物上清。OD值为3次测定的平均值。

Note:AStock solution is bacterial suspension of 108CFU·mL-1;BStock solution is pyrolysis products of 108CFU·mL-1bacteria suspension;CStock solution is culture supernatant ofVibrioparahaemolyticuscultured 12 h.

3 讨 论

副溶血性弧菌耐热性溶血素(TDH)及其编码基因(tdh)是目前判断该菌毒力的主要靶标。李巧苹[8]等对tdh基因进行原核表达，并对表达产物进行免疫学特性研究，证实了重组菌表达的TDH与原始菌株产生的TDH抗原性一致，但是TDH在天然细菌中表达量极少，重组蛋白的抗血清却不与胞外产物发生反应。另一方面流行病学调查也显示了部分临床菌株并不携带tdh基因[3,9]。本研究成功表达了副溶血弧菌VopT基因 (VPA1327)，通过免疫BALB/c小鼠制备了高效价的VopT抗血清(1∶25 600)，并且抗血清能够与副溶血性弧菌的临床菌株的12 h 培养物的菌体细胞和菌体裂解蛋白特异性反应，显示了该蛋白在常规培养12 h后大量存在细胞膜上，这又可以为副溶血性弧菌毒力菌株菌体细胞的免疫检测提供一个新的检测靶标。

图4 不同培养时间的副溶血性弧菌VopT ELISA检测结果

Fig.4 Result of VopT detecting forVibrioparahaemolyticusat different culture time using ELISA.

注：a包被抗原为106CFU·mL-1的菌悬液裂解物；bOD值为3次测定的平均值；P、N分别表示阳性血清和对照血清测定值。

Notes:aCoating antigen is pyrolysis products of 106CFU·mL-1bacteria suspension;bOD value is average of 3 times; P, N signify testing value of positive serum and control serum respectively.

VPA1327是位于副溶血弧菌染色体Ⅱ上编码一种推测胞外酶T的基因[4]，史东升等发现且该基因是具有副溶血弧菌特异性的基因片段[5]。VopT基因敲除能够使副溶血弧菌毒力株的细胞毒性显著减弱，显示该基因与副溶血弧菌的致病性具有密切关系，但是目前对VopT的致病机理的研究较少。Kodama等[10]研究认为VPA1327的编码产物(VopT)是一种具有ADP-核糖基转移酶活性的效应蛋白，并且可以通过T3SS2分泌并转移到宿主细胞内的。本研究结果显示VopT重组蛋白的抗血清只与副溶血弧菌临床株特异反应，而与副溶血弧菌环境株(非致病性菌株)溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应。尽管VPA1327编码产物被推测为胞外酶，但本研究结果显示副溶血性弧菌培养9 h后胞内VopT大量表达，但主要存在于胞内或者细胞膜表面，分泌到胞外的VopT无法通过ELISA检测出，可能这种蛋白的分泌具有独特的机制。尽管沙门氏菌、志贺氏菌都存在III型分泌系统[10]，但是细胞裂解物外均未检测到VopT，表明VopT可能是副溶血弧菌毒力菌株特有的效应蛋白。VopT抗体的获得为进一步研究VopT的分泌机制和致病机理提供了材料和方法。

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Expression ofVibrioparahaemolyticusVop T protein and the specificity of its antibody against virulent strain

YANG Zhen-quan1,3,RAO Sheng-qi1,GAO Lu1,XUE Feng2,LI Ping1,FANG Wei-ming1,JIAO Xin-an3

(1.College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China;2.Animal, Plant and Food Inspection Center of Jiangsu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China;3.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou 225009, China)

The aim of this study is to determine group specificity ofVibrioparahaemolyticusVop T protein and provide bases for establishing a rapid detection method and exploring the mechanism of VopT action. The gene VPA1327 which encode Vop T protein was amplified from pathogenicV.parahaemolyticusstrain WX06152 (serotype O3∶K6) by PCR using a pair of synthesized primers. The resulted amplicon in the size of 711 bp was subcloned into vector pET-30a (+), and the resulted recombinant expression plasmid pET-VPA1327/DE3 was transformed into theE.coliBL21 (DE3). After IPTG induction, a recombinant protein was identified using MALDI-TOF-MS/MS spectrum and purified by His affinity column. The antiserum against the VopT was successfully obtained by immunization of the purified recombinant protein to BALB/c mice, and an indirect ELISA for rapid detecting VopT protein of pathogenicV.parahaemolyticuswas developed using the antiserum as the detective antibody. The result showed that the obtained fussion protein, in the size of 33 kDa, showed the same peptide fingerprint with theV.parahaemolyticusVopT protein. The developed indirect ELISA method can specifically detect bacterial cell and its lysate ofV.parahaemolyticuswith the lowest detective limit of 105CFU mL-1. The result of crossing test showed that the VopT antiserum had good specificity against virulent strains ofVibrioparahaemolyticus, and no cross-reaction observed with environmental strains ofV.parahaemolyticusand selected bacterial strains belonging to other species. The data present in this study provides a new way to understand VopT action mechanism of pathogenicV.parahaemolyticusstrains.

Vibrioparahaemolyticus; VopT protein; prokaryotic expression; polyclonal antibody; specificity

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.011

1.扬州大学食品科学与工程学院，扬州 225127; 2.江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，南京 210001； 3.扬州大学江苏省人兽共患病重点实验室， 扬州 225009

R378

A

1002-2694(2015)05-0441-06

2014-10-09；

2015-02-16

江苏省科技支撑计划项目(No. BE2013733)、苏北科技发展计划项目(No. BC2013438)联合资助