实时荧光定量PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

实时荧光定量PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

范岩岩，张廷荣

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种高度接触性传染病，尤其是对母猪，该病毒严重影响其繁殖性能。实时荧光定量PCR以其快速、可靠的诊断技术，为检测和诊断PRRSV开辟了新方法。文内对国内外实时荧光定量PCR技术在PRRSV研究中的应用作了综述。

实时定量PCR；检测；猪繁殖与呼吸综合征病毒；鉴别诊断

实 时 荧 光 定 量PCR（Realtime PCR）技术 在1996年 由美国Applied Biosystems公司推出。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，其与常规PCR相比，它具有特异性强、自动化程度高、能够解决PCR污染问题等特点，目前已在生物学和医学研究领域中得到广泛应用。

1  实时荧光定量PCR的技术原理

Real-time PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般而言，荧光扩增曲线可以分成3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光背景信号指数扩增阶段和平台期。

1.1 工作原理

在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收；刚开始时， 探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，只有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的量形成完全同步[1]。

1.2 定量原理

在Real-time PCR反应的指数扩增阶段，首先设定一定的荧光信号的域值，一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，若测到荧光信号超过域值，就被认为是真正的信号，可用于定义样本的域值循环数Ct。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，即PCR扩增过程中，荧光信号开始由于本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环参数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[2-4]。

1.3 荧光标记探针

目前国内外已经研究出几种相关的技术，总体上可分为水解探针和杂交探针2类。水解探针有TaqManTM、TaqMan MGB、Universal probe library LNA等； 杂 交 探 针 有Scorpions TM/Amplifluor TM、Dual-oligo FRET pairs、Molecular Beacons、LUX等[5]。

2  实时荧光定量PCR技术在PRRSV上的定量检测及诊断

2.1 PRRSV定量检测

PRRS被认为是世界范围内养猪业最为重要的传染病之一，是由于受到PRRSV感染。2006年我国多个省份的养猪场出现了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫情，使养猪业蒙受了重大的经济损失。国外对此病毒作了较多的研究，如公猪感染PRRSV后，发现其精液品质下降，影响公猪繁殖性能[6-8]。因此如能在早期诊断中加以鉴别，采取相应的预防治疗措施，对动物群体疫病的防治具有重要意义，但常规诊断方法由于其自身的缺陷很难满足实际生产应用中的需要。常规PCR存在自身的缺点，其实验周期长、成本高且容易发生交叉感染，导致无法对PRRSV准确定量，而实时荧光定量PCR技术不仅实现了对PRRSV的定性，而且还实现了对PRRSV的定量检测。

国外学者E.Christoph[9]等报道了一种基于TaqMan技术的实时PCR，对PRRSV最低检测量为1TCID50。黄娟等[10]在TaqMan技术基础上建立了快速定量检测PRRSV的Real-Time PCR方法，并用该方法检测患病猪的肺脏等样品，具有较高的特异性和重复性，设定PRRSV细胞培养物的检测下限为0.01TCID50，比常规RT-PCR的敏感性高100倍，对10份PRRS疑似猪肺脏样品检测出5份为阳性，与病毒分离的阳性符合率为100%。建立的PRRSV实时PCR方法敏感性高，特异性强，操作方便快速，而且不容易造成分子生物学方面的污染，可为PRRSV诊断、感染和监测、进出口肉品安全检测及PRRSV致病机理等基础研究提供了有效手段。

对于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的检测，2008年Xiao等[11]建立了专门针对HPPRRSV的荧光定量RT-PCR方法，该方法敏感性可达到1个TCID50/ mL。但该方法不能检测到经典美洲型PRRSV，也不能判定样品是否有经典毒株和高致病毒株。杨宗照等[12]根据GenBank中的HP-PRRSV基因组序列设计特异性引物，建立一种基于SYBR GreenⅠ实时PCR检测HPPRRSV的方法。结果表明，该方法能够检测到HP-PRRSV的存在，不与其他猪源病毒发生非特异性反应，标准曲线线性范围覆盖了 1×102～1×1011拷贝 /2 µL。与常规PCR方法相比，两者的符合率100%。该方法具有快速、简便、敏感等优点，具有重要的实用价值。

牛伟等[13]针对 PRRSV ORF5 结构蛋白基因设计了引物，应用 Realtime PCR 技术对不同疑似发病猪场采集的病料进行了检测，对反应条件优化、绘制出 SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR 标准曲线，并对其特异性、重复性进行分析。结果表明：标准曲线的线性度较好，PCR 的扩增效率也比较好，可见 Real-time PCR 检测方法具有较高的可重复性，从而保证了不同样品间检测结果的可靠性和稳定性，将不同稀释度的标准品 PRRSV分别进行 PCR 扩增，用统计学软件分析表明，所建立的Real-time PCR 在组间和组内都具有良好的重复性(P＞0.05)，相关系数均大于0.99。阴性对照没有出现特性扩增。用实时荧光定量PCR检测方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及其变异株不仅特异性好、灵敏度高，且快速简便。

2.2 PRRSV的鉴别及其诊断

该病自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家和地区。PRRSV可分为欧洲型和美洲型，二者基因组序列差异相对较大，分别以1991年荷兰分离的LV和1992年美国分离的VR-2332为代表毒株。该病在我国呈蔓延趋势，流行毒株为美洲型。国外学者M Spagnuolo-Weaver等[14]在2000年首先建立了检测SYBR GreenⅠ荧光信号的欧洲型和美洲型PRRSV的荧光定量PCR方法来鉴别这2种抗原型。传统诊断方法费时、准确性低，而多重 PCR 不仅保留了普通 PCR 特异性强、灵敏度高的优点且可在同一体系中扩增多个病原的基因片段，具有节约时间、节省人力物力等优点，能够对疾病做到快速、准确的诊断，适合大量临床样品，特别是混合感染样品中多种病原体的快速检测[15-16]。

2006年春季以来，猪“高热综合征”在我国南方大部分地区流行，该病流行范围广、传播速度快、持续时间长，蔓延到全国大部分地区。经查明导致该疫情的病原是HP-PRRSV。

Bernhard Z等 研 究 得 到HPPRRSV在Nsp2固定区域缺失90个核苷酸，这为实时荧光定量RT-PCR方法鉴别HP-PRRSV提供了理想位点。徐引弟等[17]参考PRRSV的Nsp2基因序列，在Nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物，在小缺失区设计1条上游引物，用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物，与变异株共用下游引物，用于普通株的扩增，建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测，部分阳性结果测序，变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明，该方法特异、快速、简便，可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。张文利等[18]在PPRSV的Nsp2基因和ORF7基因区域分别设计不同荧光标记的MGB探针及特异性引物。这2种探针能够分别特异结合GDrl80疫苗株、GD野毒株。该方法一次检测就能够同时区别GDrl80株与其他病毒株，对疫苗的纯净性检测、田间使用后的跟踪及与野毒感染的鉴别检测均具有重要作用。

2.3 多重实时荧光定量PCR的检测

Wernike K等[19]建立了一种鉴别PRSSV变异型、美洲型和欧洲型的多重Real-time PCR，该方法敏感性高，能够从样品中检测出少于200拷贝/ µL欧洲型PRRSV以及20拷贝/µL的美洲型和变异型PRRSV。施开创等[20]首次利用2对引物和3条探针，研究建立区分野毒株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR，为PRRSV美洲型野毒株、疫苗株的快速鉴别检测及流行病学调查提供了有效的技术手段。 曲哲会等[21]根据GenBank中登陆的PRRSV经典株、HP-PRRS株和CSFV（猪瘟病毒）基因组全系列，分别设计了2对特异性引物，建立了实时荧光定量PCR检测方法，可同时对PRRSV和CSFV进行检测，同时可以鉴别PRRSV经典株和HP-PRRSV株，为2种疫病的鉴别和混合感染的诊断提供了一种病原快速检测的方法。该方法特异性的检测PRRSV经典株、HPPRRS株和CSFV，具有良好的特异性。

3  存在的问题

实时荧光定量PCR技术优点很多，但是在Real-time PCR技术中，无论是相对量还是标准曲线定量方法都存在着一些问题：

1）在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程，目前由于无统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品不相同，致使实验结果缺乏可比性；

2）Real-time PCR用 于 研 究mRNA时，受到不同RNA样本和不同逆转录效率的限制；

3）运用封闭式的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，无法确定扩增产物的大小；

4）由于荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了Realtime PCR检测应用能力；

5）自动化仪器和试剂成本比较高。

4  发展前景

随着技术不断改进和发展，目前实时荧光PCR技术已成为科研的主要工具，一方面实时荧光定量PCR技术与其他分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。此外， Real-time PCR技术在动物检疫和环境监测等方面也得到了广泛的应用，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的。

实时荧光PCR技术的发展使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的手段去研究许多重要的基础课题。虽然此技术仍存在一些不足需要改进，但是它为实时荧光PCR技术在常规诊断检测中的运用打下了良好的基础，实时荧光PCR技术将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具。它为研究PRRSV 提出了新思路，实现了对PRRSV进行较准确的定量，也为PRRSV与其混合感染的诊断提供了一种新途径。

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2015-03-30)