贵州省2013年人间布鲁氏菌病病原体种/型鉴定与分析

刘 英，王 月，马 青，李世军，黄 艳，周敬祝，余 春，田克诚，唐光鹏，王定明

贵州省2013年人间布鲁氏菌病病原体种/型鉴定与分析

刘 英，王 月，马 青，李世军，黄 艳，周敬祝，余 春，田克诚，唐光鹏，王定明

目的 对2013年贵州省人间布鲁氏菌病疑似病例进行病原学诊断与分析，为病例的确诊和疫情控制提供病原学依据。方法 采用传统方法和分子生物学方法对从布鲁氏菌病疑似患者血液分离的可疑布鲁氏菌进行鉴定和分析。结果 从疑似患者血液分离出可疑菌株13株，传统方法将其中的11株经鉴定为羊种生物3型布鲁氏菌，其余2株未能定种/型。布鲁氏菌属特异性PCR(BCSP31-PCR)将13株菌株鉴定为布鲁氏菌属细菌，种/型特异性PCR(AMOS-PCR)将其中的11株鉴定为羊种布鲁氏菌，其余2株未能定种/型。结论 2013年贵州省人间布鲁氏菌病病例共分离出13株布鲁氏菌，羊种生物3型布鲁氏菌为贵州省2013年人间布鲁氏菌病病原体的主要流行菌种/型，占84.6%(11/13)，该研究结果为布病病例的确诊和疫情的控制提供了病原学依据。

布鲁氏菌病；病原学诊断；PCR；贵州

布鲁氏菌病(Brucellosis)(以下简称布病)是由布鲁氏菌属(Brucella)的细菌侵入机体引起世界性、多宿主感染的人兽共患病[1]。贵州省于2010年首次从贵州省山羊血液分离到羊种布鲁氏菌,证实了畜间布病的存在[2],2012年从1例患者全血中分离到羊种布鲁氏菌，证实了贵州省人间布鲁氏菌病疫情的存在[3]。随后布病疫情在我省迅速扩散，散发和爆发疫情时有发生，直至2012年疫情已覆盖我省贵阳、黔南、黔东南、铜仁、遵义、黔西南和六盘水7个州(市)，防控形势非常严峻。本研究采用传统和分子生物学方法对贵州省2013年从患者血液分离的13株布鲁氏菌可疑菌株进行鉴定和分析，为病例的确诊和疫情控制提供病原学依据。

1 材料和方法

1.1 实验菌株 实验菌株为从贵州省2013年27例布病抗体阳性的疑似布病患者血液标本分离的布鲁氏菌可疑菌株13株(命名为GZ13MCB、GZ13WYL、GZ13WYT、GZ13HJW、GZ13DGY、GZ13ZXY、GZ13LDZ、GZ13LXC、GZ13ZC、GZ13ZFH、GZ13YTX、GZ13CB、GZ13ZSX)，其中遵义市8株，贵阳市2株，务川县2株，铜仁地区1株。阳性对照菌株为布鲁氏菌疫苗株A19(牛种)、M5(羊种)和S2(猪种)(购自兰州生物制品研究所)

1.2 主要试剂 布鲁氏菌培养基采用进口布鲁氏菌肉汤(BD公司，货号为211088)和布鲁氏菌琼脂(BD公司，货号为211086)成品培养基按照说明书配制成双相培养基(培养瓶)。冻干布鲁氏菌阳性血清、冻干布鲁氏菌单项特异性血清(A、M、R)和布鲁氏菌特异噬菌体(Tb和Wb)均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。TaKaRa PCR相关试剂购买于大连宝生物公司。

1.3 传统方法鉴定 革兰氏染色、单因子血清凝集实验、噬菌体裂解实验等传统实验按照《布鲁氏菌防治手册》提供的方法进行[ 4]。

1.4 DNA提取 挑取布鲁氏菌可疑菌落接种于布鲁氏菌琼脂平板培养48 h后采用水煮法提取细菌核酸。

1.5 BCSP31-PCR法鉴定布鲁氏菌属 采用布鲁氏菌属特异性基因BCSP31作为定属基因，按照参考文献[5]提供的B4和B5引物序列和参数进行扩增，B4和B5引物序列见表1。

1.6 AMOS-PCR 法鉴定布鲁氏菌种/型 采用参考文献[6]提供的以布鲁氏菌属IS711插入序列为基础建立的AMOS-PCR引物及参数进行布鲁氏菌种/型的鉴定(见表1)。

2 结 果

2.1 菌落观察 将疑似菌株转接布鲁氏菌琼脂培养基培养48 h后，菌落大小约0.5 mm、圆形、边缘整齐、无色半透明、呈露滴状、折光明亮，表面光滑湿润、稍隆起、均质样，符合布鲁氏菌的菌落形态特征。

2.2 染色鉴定 对转接菌株培养后的菌落进行革兰氏染色镜检，结果为革兰阴性、红色、短小杆菌，多为单个，有少数双或链状排列。

2.3 常规方法鉴定布鲁氏菌种/型 布鲁氏菌单相特异性血清A、M和R与可疑菌落凝集试验及噬菌体裂解实验结果显示，本研究中的13株布鲁氏菌疑似菌株中的11株菌株为羊种生物3型，而其余2株不能确定鉴定结果(表2)。

2.4 BCSP31-PCR鉴定 煮沸法提取菌株核酸，经BCSP31-PCR扩增后，采用1.5%琼脂糖电泳检测扩增产物，结果显示本研究中的13株分离菌株及阳性对照均出现分子量大小为223 bp的特异条带，而阴性对照无条带出现，结果见图1。

2.5 AMSO-PCR检测结果 AMOS-PCR对分离菌株和阳性株菌核酸进行扩增，产物经1.5%琼脂糖电泳检测，结果显示，本次分离菌株中的11株出现分子量大小为731 bp的特异条带，阳性对照菌株均出现预期特异条带，而阴性对照及2株(GZ13CB和GZ13ZSX)分离株无条带出现(见图2)。

3 讨 论

传统的分类方法将布鲁氏菌分为羊、牛、猪、犬、绵羊附睾和沙林鼠6个生物种共19个型，即牛种布鲁氏菌B.abortus8个型；猪种布鲁氏菌B.suis5个型；羊种布鲁氏菌B.melitensis3个型；犬种布鲁氏菌B.canis、绵羊附睾种布鲁氏菌B.ovis和沙林鼠种布氏菌B.neotomae各1型。因其生物种、型和菌株的不同，致病力各异，对人致病力最强的为羊种菌，其次为猪种菌，牛种菌对人致病力弱。

M: Marker; 1-13: Strains GZ13MCB, Z13WYL, GZ13WYT, GZ13HJW, GZ13DGY, GZ13ZXY, GZ13LDZ, GZ13LXC, GZ13ZC, GZ13ZFH, GZ13YTX, GZ13CB and GZ13ZSX;14: A19; 15: M5; 16: S2; 17: Negative control.

图1 布鲁氏菌可疑菌株 BCSP31-PCR结果

Fig.1 Identification results ofBrucellasuspicious strains using BCSP3l-PCR

M: Marker; 1-13: Strains GZ13MCB, Z13WYL, GZ13WYT, GZ13HJW, GZ13DGY, GZ13ZXY, GZ13LDZ, GZ13LXC, GZ13ZC, GZ13ZFH, GZ13YTX, GZ13CB and GZ13ZSX;14: A19; 15: M5; 16: S2; 17: Negative control.

图2 布鲁氏菌可疑菌株AMOS-PCR鉴定结果

Fig.2 Identification results ofBrucellasuspicious strains using AMOS-PCR

据资料显示[7]，既往鲜有病例的我国南方布病疫情日趋严重，不仅有与北方相同的羊种布鲁氏菌引起的病例，还有因牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌引起不同体征的感染者，使布病疫情复杂化。贵州省地处我国西南片区，布病为贵州省近年新发传染病，尽管既往监测结果显示贵州省分离布鲁氏菌均为羊种生物3型布鲁氏菌[2-3]，但及时了解布病疫情的病原体及其种型分布对病例的确诊和疫情的控制至关重要。

本研究中我们对2013年贵州省患者血液分离的13株布鲁氏菌可疑菌株进行鉴定和分析，结果显示其中的11株可疑细菌为羊种生物3型布鲁氏菌。然而，传统分型方法虽然是目前布氏菌分型的金标准，但是受到干扰因素较多，对非典型菌株鉴定分类时，出现了难以鉴定的问题[7]。本研究中2株菌(GZ13CB和GZ13ZSX)经传统的噬菌体裂解实验和单因子血清凝集试验未能定种/型可能与菌株的特殊性而不能采用传统方法鉴定出种/型有关。

BCSP31-PCR是以布鲁氏菌属特异基因BCSP31为靶基因的检测技术，李兰玉等[5]曾专门对基于该基因设计的引物B4和B5进行了研究，结果对6个种的布鲁氏菌DNA都有特异的扩增条带[8-9]，因此，本实验中选 BCSP31- PCR做为布鲁氏菌定属检测方法，结果分离自布鲁氏病疑似病人血液的菌株经BCSP31基因检测证明全部为布鲁氏菌属细菌。AMOS-PCR根据条带情况可鉴别布鲁氏菌牛、羊 、猪种和绵羊附睾种。该方法在国内外的布鲁氏菌种型鉴定中得到了广泛应用[10-13]，国内学者姜海等[6]采用AMOS-PCR鉴定不同种型的研究结果显示，AMOS-PCR鉴定结果与传统方法符合率非常高。为了更准确的种/型鉴定，本实验在传统鉴定方法检测的基础上采用AMOS-PCR对可疑菌株进行进一步鉴定，结果显示可疑菌株中检出11株羊种布鲁氏菌，与传统方法检测结果一致。然而，AMOS-PCR在检出范围上只能鉴别布鲁氏菌牛种1、2、4型(498 bp)、羊种布鲁氏菌(731 bp)、猪种l型(285 bp)、绵羊附睾种(96l bp)[6]，而其余型别的牛种布鲁氏菌(3、5、6、7、和9型)和猪种布鲁氏菌(2、3、4、5型)、犬种及沙林鼠种布鲁氏菌等均不在AMOS-PCR的检测范围以内，本研究中的2株菌株(GZ13CB和GZ13ZSX)采用该技术检测为阴性可能与AMOS-PCR技术本身的检测范围有关。

贵州省2010和2011分别从病原学角度证实了布病在畜间和人间布病的存在后[2-3]，布病疫情在贵州省迅速扩散，防控形势非常严峻。本研究结果显示，贵州省2013年人间布鲁氏菌病患者分离菌株中的羊种生物3型布鲁氏菌占84.6%(11/13)，提示羊种生物3型布鲁氏菌为贵州省2013年间主要流行种/型，羊为贵州省人间布病的主要传传染源，该结果与全国布病病原体种/型分布一致[11]。因此，在畜牧业发展中，相关部门应加强动物(尤其是羊)间布病的防控。此外，流行病学调查资料显示本研究中未能定种/型的2株菌GZ13CB和GZ13ZSX均分离自养牛从业人员血液标本，提示上述2株不在AMOS-PCR检测范围内的菌株为牛种布鲁氏菌(牛种生物3、5、6、7、和9型)，但贵州省未见有牛种布鲁氏菌的报道，是否为贵州省2013年新出现了牛种布鲁氏菌的流行尚需要对上述两株菌株进行进一步的鉴定才能确定。

[1]Shang DQ. Brucellosis raging again and the reasons[J]. Chin J Contr Endem Dis, 2001, 16(1):29-34. (in Chinese) 尚德秋. 布鲁氏菌病再度肆虐及其原因[J]. 中国地方病防治杂志,2001, 16(1):29-34.

[2]Li SJ, Wang Y, Chen H, et al. Isolation and Identification ofBrucellamelitensisfirstly isolated from goat in Guizhou province[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(6):515-518. (in Chinese) 李世军，王月，陈红，等. 贵州省首次从山羊分离到布鲁氏菌及其种型鉴定[J]. 中国人兽共患病学报, 2011, 27(6):515-518.

[3]Li SJ, Wang Y, Chen H, et al. Etiologic diagnosis and analysis of the first case of human brucellosis in Guizhou province[J]. Chin J Endem Dis, 2012, 31(5):69-71. (in Chinese) 李世军，王月，王定明，等. 贵州省首例人间布鲁氏菌病病例的病原学诊断与分析[J]. 中国地方病学杂志, 2012, 31 (5) : 69-71.

[4]Disease Prevention and Control Bureau, the Ministry of Health. Brucellosis prevention manual[M]. Beijing: People’s Publishing House. 2008: 17-29. (in Chinese) 卫生部疾病预防控制局.布鲁氏菌病防治手册[M]. 北京：人民出版社, 2008：17-29.

[5]Li LY, Qiu HY, Shang DQ. A study on the PCR about primers of 31 kDa protein gene forB.abortus[J]. Chin J Endem Dis, 2000, 15(4):196-198. (in Chinese) 李兰玉，邱海燕，尚德秋.牛种布鲁氏菌31 kDa蛋白基因引物的PCR试验(I) [J]. 中国地方病防治杂志, 2000, 15(4):196-198.

[6]Hai J, Cui BY, Zhao HY. Study on identification ofBrucellaspp. using AMOS PCR[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(2):107-109. (in Chinese) 姜海，崔步云，赵鸿雁. AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2009, 25(2):107-109.

[7]Cui BY.Brucellaepidemic situation and vaccine research in China[J]. Chin J Epidemiol, 2012, 31(4):355-356. (in Chinese) 崔步云. 关注中国布鲁杆菌病疫情发展和疫苗研究[J].中国地方病学杂志, 2012, 31(4):355-356.

[8]Cui BY, Yin JM, Li LY, et al. Typing ofBrucellaIsolates by repetitive element sequence-based polymerase chain reaction[J]. Dis Surveill, 2005, 20(8):397-400. (in Chinese) 崔步云，尹继明，李兰玉，等. 布鲁氏菌的Rep-PCR分型研究[J]. 疾病监测, 2005, 20(8):397-400.

[9]Chen JD, Deng XL, Ke BX, et al. Etiological analysis of brucellosis in Guangdong province[J]. Dis Surveill, 2008, 23(5):227-229. (in Chinese) 陈经雕，邓小玲，柯碧霞，等. 广东省布鲁氏菌病病原学特征分析[J]. 疾病监测, 2008, 23(5):227-229.

[10]Wang L, Ma GZ. The research for diagnosing brucellosis patients with PCR technology[J]. Chin J Endem Dis, 2004, 19(2):65-67. (in Chinese) 王丽，马国柱. PCR技术用于布鲁氏菌病的诊断研究[J].中国地方病杂志, 2004, 19(2):65-67 .

[11]Peng XB, Chen JS, Xia YC, et al. A Multi-PCR assay for differentiating the strains ofB.abortus,B.melitensisandB.suis[J]. Chin J Vet Drug, 2010, 44(2):12-14. (in Chinese) 彭小兵，程君生，夏业才，等. 多重PCR方法鉴别牛、羊、猪种布鲁氏菌株[J]. 中国兽药杂志, 2010, 44(2):12-14.

[12]Di Giannatale E, De Massis F, Ancora M, et al. Typing ofBrucellafield strains isolated from livestock populations in Italy between 2001 and 2006[J]. Vet Ital, 2008, 44(2):383-388.

[13]Matope G, Bhebhe E, Muma JB, et al. Characterization of someBrucellaspecies from Zimbabwe by biochemical profiling and AMOS-PCR[J]. BMC Res Notes, 2009, 22(2):261. DOI:10.1186/1756-0500-2-261

Etiologic identification and analysis of the human brucellosis in Guizhou Province, China, 2013

LIU Ying,WANG Yue,MA Qing,LI Shi-jun,HUANG Yan,ZHOU Jing-zhu,YU Chun,TIAN Ke-cheng,TANG Guang-peng,WANG Ding-ming

(GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China)

In order to etiologically diagnose and analyse the suspected patients of brucellosis and provide etiologic basis for the confirmation of patients and the control of human brucellosis in Guizhou Province, conventional and molecular techniques were used to identify suspicious bacteria strains isolated from the suspected patients of brucellosis. Results showed that a total of 13Brucellasuspicious bacteria strains were isolated and 11Brucellasuspicious strains were identified asB.melitensisbiotype 3 by conventional tests, with 2 strains unable to be identified. Genus specific BCSP31-PCR identified all the 13 bacteria strains asBrucellaspp. Species-specific AMOS-PCR further identified the 11 strains asB.melitensis, and the 2 strains unidentified with conventional tests were also unable to be identified with AMOS-PCR. Results of this study suggested thatB.melitensisbiotype 3 were the main epidemicBrucellain Guizhou Province in 2013, accounting for 84.6% (11/13), which provided etiological basis for the diagnosis of patients and the control of human brucellosis.

brucellosis; etiologic identification; PCR; Guizhou

Li Shi-jun, Email:zjumedjun@163.com

贵州省科技公关计划社会发展项目(黔科合SY[2013]3049)和贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2013]2166号)联合资助

李世军，Email：zjumedjun@163.com

贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.010

R378.5

A

1002-2694(2015)01-0045-04

2014-06-10；

2014-10-23

Supported by the grant from the Science and Technology Projects for Social Development in Guizhou Province (No. SY[2013]3049) and the Program of Natural Science Foundation of Guizhou Provincial Government (No. J[2013]2166)