酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术在沙眼衣原体检测中的应用比较

高毅云 刘传桂

沙眼衣原体是一种特别常见的生殖系统病原菌，可以在男性尿道和女性阴道内大量繁殖，在阴道炎或非淋球菌性及淋球菌性尿道炎中均有较高检出率，是一种典型的性传播疾病[1-2]。口腔、直肠、生殖道和眼结膜等是主要的发病部位，可诱发沙眼、包涵体包膜炎、泌尿生殖道感染、性病淋巴肉芽肿等疾病，对患者危害极大[3]。沙眼衣原体感染常表现急性症状、低症状或无症状，急需一种快速、精确、灵敏的检测方法。目前临床上有很多种检测沙眼衣原体的方法，其中细胞培养法是公认的金标准，但是细胞培养耗时长、条件高，不适合大样本检测，本研究通过临床对比，探讨酶联免疫吸附测定法（ELISA）和免疫胶体金技术在沙眼衣原体检测中的应用情况，旨在为沙眼衣原体的检测提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月-2014年1月来本院就诊的90例疑似沙眼衣原体感染患者作为研究对象，其中男39例，女51例，年龄19~71岁，平均（38.2±3.7）岁，病程1~8周，大部分患者无明显症状，少数出现尿频、尿急现象甚至产生脓性分泌物，所有患者排除淋球菌感染的可能。

1.2 方法

1.2.1 取样方法 女性患者宫颈标本采集：首先以无菌大棉签清洁宫颈口处的分泌物，再另取1根棉签插入到宫颈1~2 cm处，缓慢旋转数次，期间不能触碰到阴道内壁，取出棉签后放入传送管中[4]。男性患者尿道样本采集：嘱患者采样前1 h勿小便。使用尿道拭子缓慢插入到尿道2 cm处，稍用力旋转一圈后停留半分钟取出，备用。如尿道中含有分泌物，应先检查淋球菌。所有患者同时采集3份标本，且室温下放置时间不超过4 h，并分别根据检测方法的具体要求分类处理。

1.2.2 检测方法 分别对3份标本采用细胞培养法、酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金技术进行检验，其中细胞培养法和酶联免疫吸附测定法严格按照临床要求、操作说明进行。

ELISA检测：将棉签标本放入加有1000 μL红色裂解液的裂解管中，95 ℃水浴20 min，冷却15 min后挤压棉签并取出，仪器自动判别阴性或阳性结果。采用Micro Track XL System全自动酶免分析仪（购自爱尔兰Trinity Biotech Plc公司），试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供，严格按照说明书进行操作；免疫胶体金检测：向裂解管中滴入无色裂解液A液5滴，立即放入棉签，以手指挤压裂解管中棉签头，转动棉签15次并静置2 min；再向同一裂解管中竖直加入裂解液B液6滴，以手指挤压裂解管中棉签头，转动棉签15次并静置1 min。挤干裂解管中棉签头后弃去，旋紧裂解管滴头加入加样孔进行测定。需要注意的是检测时应在10~20 min内查看结果，超过20 min后结果无效，如果出现2条红色条带则表示患者为阳性，如果仅出现1条红色条带表示患者为阴性[5]。

1.3 计算方法 以细胞培养的检测结果作为“金标准”来计算酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金技术的灵敏度和特异度，灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%。特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%[6]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行统计学处理，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测结果的比较 采用酶联免疫吸附测定法检测90例疑似沙眼衣原体感染的患者，结果阳性患者12例，阳性检出率为13.3%，其中男性阳性检出率为17.9%（7/39），占总数的7.8%（7/90），女性阳性检出率为9.8%（5/51），占总数的5.6%（5/90）。免疫胶体金检测出阳性患者10例，检出率11.1%，其中男性阳性检出率为12.8%（5/39），占总数的5.6%（5/90），女性阳性检出率为9.8%（5/51），占总数的5.6%（5/90）。两种方法在检测女性患者沙眼衣原体阳性率方面比较差异无统计学意义（P>0.05），在检测男性患者沙眼衣原体阳性率方面比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 两种方法灵敏度和特异度的比较 采用细胞培养作为检测沙眼衣原体感染的“金标准”，结果90例患者中阳性13例，酶联免疫吸附测定法检测结果中假阳性患者1例，假阴性患者2例，灵敏度91.7%，特异度97.4%；免疫胶体金技术检测结果中假阳性患者1例，假阴性患者4例，灵敏度90.0%，特异度95.0%。两种方法在检测沙眼衣原体阳性率的灵敏度和特异度上比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

沙眼衣原体属于一种极为常见的性传播疾病，平均感染潜伏期为1~3周，具有发病率高、危害大、易复发等特点[7-8]。目前全世界范围内由沙眼衣原体引起的性传播疾病发病率呈逐年上升趋势[9]。沙眼衣原体主要易感部位包括口腔、直肠、生殖道和眼结膜等，可使患者产生沙眼、包涵体包膜炎、泌尿生殖道感染、性病淋巴肉芽肿等疾病。泌尿生殖系统被沙眼衣原体感染的患者会出现尿急、尿痛等症状，女性患者还会并发宫颈内膜炎，表现为黄色黏液脓性分泌物增多、触之易出血、水肿、充血及腹部不适等症状，亦有相当数量患者症状轻微或无任何临床症状[10]；男性患者常并发尿道炎，表现为尿痛、刺痒、尿道分泌物增加等症状[11]。如果沙眼衣原体寄生在男性尿道或者前列腺上皮细胞内，会破坏患者的产精和排精功能，造成男性不育等情况。因此，找到更为简便、快捷的检测方法来尽早的确诊沙眼衣原体的感染情况具有重要的意义。目前临床上检测沙眼衣原体的方法有很多种，主要包括细胞培养法、ELISA法、荧光定量聚合酶链反应、免疫胶体金技术等。因为细胞培养法的敏感度和特异度非常高，培养结果无假阳性，常作为国际上检测沙眼衣原体的实验室诊断“金标准”，但是细胞培养周期长、操作复杂、需要侵入性取材及成本高，不适合作为基层医院的常规检测方法[12]。荧光定量聚合酶链反应敏感性及准确性高，但检测成本及适用条件较高，基层医院应用较少。ELISA法和免疫胶体金技术条件要求不高，一般实验室即可满足，故应用较为广泛。

免疫胶体金技术是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应对抗原或抗体进行定性、定量分析的标记方法，按抗原抗体反应原理可分为双抗体夹心法、双抗原夹心法、捕获法以及竞争抑制法，属于一种常见的固相标记免疫标记技术。免疫胶体金标记可用于常规光镜、透射电镜及扫描电镜，可同时检测多种物质，对组织细胞非特异性吸附作用小，具有高敏感性及高特异性。胶体金本身为鲜艳橘红色，是高电子密度颗粒性标记物，可根据金颗粒数目于不同视野中对抗原进行本定量分析，极少遮盖超微结构，定位能力精确。金颗粒激发电子能力强，用于X射线衍射及扫描电镜分析，可对多糖、多肽、蛋白质、凝集素及抗体葡萄球菌蛋白A等生物大分子物质进行标记。研究表明，免疫胶体金技术在食品安全检测领域得到了广泛应用。郭建等[13]采用国家标准方法验证粮食中玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇两种真菌毒素的胶体金快速测试卡效果，证实了胶体金检测在粮食中的稳定性、准确性、适用性及重复性。另外，真菌毒素及违禁药物检测中亦显示出它的优势。李月越等[14]对同一份标本甲型及乙型流感病毒采用间接免疫荧光法和胶体金免疫层析法进行检测，显示一致性较好，表明免疫胶体金技术操作简单，可单份检测，结果直观，敏感性及特异性高。

另外，该检测方法不需要任何仪器设备和试剂，几分钟即可得到实验结果并用肉眼可以观察到，试验结果可随时保存，适合于大面积普查、大批量时间紧及野外作业人员检测，可在基层医院及单位推广。酶联免疫吸附测定法是一种在免疫酶技术基础上发展起来的新型特殊试剂分析方法，属于将抗原抗体免疫反应及酶高效催化作用原理有机结合起来的检测技术，基本原理为借助于酶的高效性使某种固相载体与具有免疫活性的抗原或抗体结合，检测时加入受检样品和酶标记物，洗涤后加入酶催化底物，进而实现对物质的定性及定量检测。酶联免疫吸附测定法中酶活性易受反应条件影响，因此存在重复性及准确性差等问题。此外，酶联免疫吸附测定法需低温保藏，试剂寿命短，但操作方便，在疾病预防、食品检测及临床检验诊断中意义重大，具有重复性好、特异强、敏感性高及漏检率低等显著优势。宿俊彪等[15]采用酶联免疫吸附测定法对乙肝病毒患者标记物进行检测，得到各项血清标志物检测较好，人为干扰因素较少，提示酶联免疫吸附测定法有助于提高检测特异性及灵敏度。研究表明，酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术灵敏度基本相近，多数试验敏感度均可达到1 ng/mL或更低水平[16]，证实了两种检测方法较高的应用价值。

为了找到更为简便、快捷的检测方法，本研究选取2012年1月-2014年1月来本院就诊的90例疑似沙眼衣原体感染患者作为研究对象，探讨酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术在沙眼衣原体检测中的应用情况。结果发现酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术对于沙眼衣原体检测均为非常有效的方法，两种方法在检测沙眼衣原体阳性率灵敏度及特异度上无显著差异，但酶联免疫吸附测定法男性阳性率明显高于免疫胶体金技术，表明酶联免疫吸附测定法在检测男性沙眼衣原体感染方面更具优势，与此同时，免疫胶体金技术耗时时间较酶联免疫吸附测定法明显缩短。因此临床上两种方法灵活运用，患者较少而且急需结果时可以选用免疫胶体金技术检测，患者较多时，用酶联免疫吸附测定法检测。对于不急于要求检验结果的男性患者，可以积攒到一定数量后集中进行检验，不但可以保证男性患者的感染检出率，也可以大大节省成本、提高效率。

综上所述，酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金技术均是检测沙眼衣原体较为快捷、有效的方法，基层医院可以根据实际情况灵活应用。

[1]张莉，李平，黄平，等.沙眼衣原体检测结果分析[J].国际检验医学杂志，2011，32（18）：2132-2134.

[2] Muvunyi C，Dhont N，Verhelst R.Prevalence of Chlamydia trachomatis infection among women attending infertility clinic by PCR and ELISA in Rwanda[J].International Journal of Infectious Diseases，2012，16（3）：336-336.

[3]王礼，唐恒锋.3种方法在泌尿生殖道沙眼衣原体检测中的应用和评价[J].国际检验医学杂志，2013，34（11）：1418-1419.

[4]赵琪林.沙眼衣原体感染的实验室诊断[J].中外健康文摘，2013，10（15）：168-169.

[5]乐宏元，张振国，刘晓虹，等.四种检测沙眼衣原体方法的诊断符合率分析[J].中国微生态学杂志，2011，23（6）：566-567.

[6]蒋敏，孟艳辉，何聚莲，等.沙眼衣原体相关抗体在筛查输卵管性不孕中的应用探讨[J].热带医学杂志，2014，14（1）：64-66.

[7]郭名和，郭春晓，邵永.沙眼衣原体取样方法改良对提高其检出率的效果探讨[J].检验医学与临床，2011，8（17）：2051.

[8]黄健怡.血清沙眼衣原体及其热休克蛋白60抗体反应与输卵管性不孕的相关性[J].中外医学研究，2013，11（12）：39-40.

[9]刘志超，刘原君，冯斌，等.四种检测泌尿生殖道沙眼衣原体方法的比较与评价[J].中国皮肤性病学杂志，2011，25（8）：642-643.

[10]丁海峰，吴有才，张绪利，等 泌尿生殖道沙眼衣原体感染检测分析[J].检验医学与临床，2013，10（10）：1298.

[11]黄江浩，陈宝娜，常帅，等.不同的检验方法对沙眼衣原体检测结果的影响与评价[J].国际检验医学杂志，2014，35（9）：1168-1171.

[12]安妮，葛龙，徐俊峰，等.酶免疫法对沙眼衣原体诊断价值的Meta分析[J].中国循证医学杂志，2013，13（2）：165-169.

[13]郭建，尚艳娥，张燕，等.胶体金快速测试卡检测粮食中真菌毒素的应用[J].粮食科技与经济，2012，37（1）：42-44.

[14]李月越，陈杭薇，王萍，等.胶体金免疫层析法快速检测流感病毒应用研究[J].第四军医大学学报，2008，29（18）：2561-4561.

[15]宿俊彪，白瑞霞，李慧君，等.酶联免疫吸附侧定法和电化学发光技术检侧乙肝病毒236例的结果分析[J].内蒙古医学杂志，2014，46（4）：465-466.

[16]朱文钏，孔繁德，林祥梅，等.免疫胶体金技术的应用及展望[J].生物技术通报，2010，25（4）：81-87.