茉莉酸甲酯和磷酸氢二钾诱导柱花草对炭疽病的抗性

伍康荣，刘凤民，张伟丽，陈梓健，许戴奇，黎志辉，罗喜梅，林国森(.仲恺农业工程学院生命科学学院，广东 广州 505； .仲恺农业工程学院教学科研基地，广东 广州 505)

茉莉酸甲酯和磷酸氢二钾诱导柱花草对炭疽病的抗性

伍康荣1，刘凤民2，张伟丽1，陈梓健1，许戴奇1，黎志辉1，罗喜梅1，林国森1
(1.仲恺农业工程学院生命科学学院，广东 广州 510225； 2.仲恺农业工程学院教学科研基地，广东 广州 510225)

探究茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)和磷酸氢二钾(K2HPO4)诱导柱花草对炭疽病的抵抗作用。结果表明,二者浓度分别为0.001～0.1 mg·mL-1和10～50 mmol·L-1时,病情指数均显著降低(P<0.05)，最佳诱导浓度分别是0.001 mg·mL-1和30 mmol·L-1，诱导效果分别是64.84 %和54.40 %。0.001 mg·mL-1MeJA处理组的过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性在48 h达到最大值，显著高于对照组。30 mmol·L-1K2HPO4处理组的POD与PPO活性分别在48和24 h达到最大值，显著高于对照组。两种诱抗剂处理的POD和PPO活性在接种早期增加了柱花草对炭疽菌的侵染的抵御能力，进而提高植株的抗病性。30 mmol·L-1K2HPO4处理组的过氧化氢酶(CAT)活性在48～72 h内上升，显著高于对照组,而0.001 mg·mL-1MeJA处理组的CAT活性除72 h显著低于对照组，其他时间点与对照组相差不大。说明在诱导柱花草抗病性方面，两种诱导抗性剂处理的诱抗效果与POD、PPO和CAT的酶活性的诱导的时间及程度有关。

柱花草；炭疽病；茉莉酸甲酯；磷酸氢二钾；诱导抗性

柱花草(Stylosanthesguianesis)是热带地区一种广泛种植的优良牧草，我国于1962年从马来西亚引种作为覆盖作物，种植于海南橡胶园[1]。然而随着柱花草广泛种植，炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)已成为危害其主要病因，造成多个国家和地区的种植严重减产[2-3]。目前防治炭疽病的手段主要是化学防治,但过度使用化学农药，会造成环境污染。利用植物诱导抗性防治植物病害，可以减少化学农药的使用，保护环境，是现代植物病害防治的一条重要途径[4]。

茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)与磷酸氢二钾(K2HPO4)都是常见的植物诱抗剂。关于利用两者诱导植物抗性的研究已有报道[5-8]。但对于两者诱导柱花草抗炭疽病的研究还未见有报道。为此，本研究利用茉莉酸甲酯和磷酸氢二钾设置不同浓度对柱花草进行诱导,测定其过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)与过氧化氢酶(CAT)等相关酶的活性,探究其中的诱导机理，为柱花草炭疽病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与菌种

本研究所用的柱花草品种为CIAT184(S.guianensiscv. Reyan No.2，CIAT184)，种子来源于中国热带农业科学院热带牧草研究中心。用80 ℃的水处理柱花草种子3～5 min后，播种于灭菌盆土中，每隔15 d施一次0.2%(w/v)芭田复合肥，培养7周后备用。

菌株从广西南宁畜牧研究所试验地取病样，经分离纯化鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)[9]。将胶孢炭疽菌接种于PDA培养基中，放置于28 ℃培养4～5 d后，将产生的孢子配成1×106个·mL-1的悬浮液(加0.1%吐温)备用。

1.2 主要试剂

茉莉酸甲酯(Sigma)：用少量的丙酮溶解后，用蒸馏水配置成1 mg·mL-1母液备用。磷酸氢二钾(广东西陇化工厂,分析纯)：用蒸馏水溶解配置成0.5 mol·L-1母液备用。根据需要的工作液浓度将母液用蒸馏水稀释。

1.3 诱导处理方法

茉莉酸甲酯分别设置0.001、0.01、0.1 mg·mL-13个不同浓度。K2HPO4分别设置10、30、50 mmol·L-13个不同浓度。每种处理选用15株柱花草，每种处理重复3次。将不同浓度的茉莉酸甲酯溶液(加0.1%吐温)和K2HPO4溶液均匀喷洒在已培养7周的柱花草叶片上，直到有水滴流下为止，对照组喷洒蒸馏水(加0.1%吐温)。培养3 d后，用配制好的胶孢炭疽菌孢子悬浮液(加0.1%吐温)均匀地喷洒到植株叶片直至有水滴流下为止。将接种后的植株套袋保湿，放于人工气候箱中培养48 h(白天28 ℃，14 h；夜间25 ℃，10 h)，48 h后除去保湿袋，继续培养8 d后统计病害级数及病情指数。

1.4 病害统计方法[10]

观察每棵植株的3位叶,按叶片6级法划分(0级,无症状；1级,病斑的直径<0.5 mm；2级,病斑的直径在0.5～1.0 mm；3级,病斑的直径在1.0～2.0 mm；4级,50%叶片坏死；5级,叶片完全枯萎或脱离)统计每片叶的病级数。每棵植株病级数= (L0+ L1+ L2)/3(L0为接种时最后出来的那片未完全展开叶的病级数；L1为接种时最上面的完全展开叶的；L2为接种时第2片完全展开叶的)。按如下公式计算病情指数与诱抗效果：

病情指数=

1.5 酶活性的测定

1.5.1 试验处理 选取浓度为0.001 mg·mL-1茉莉酸甲酯、30 mmol·L-1K2HPO4处理植株,具体处理方法同1.3，再均匀喷洒已配置好的胶孢炭疽菌孢子悬浮液(加0.1%吐温)后，分别在0、24、48、72和96 h取植株顶端的三位叶测酶活性。

1.5.2 过氧化物酶(POD)活性的测定 参考张伟丽等[9]方法取0.4 g柱花草叶子置于研钵中，加入4 mL预冷的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)，加少量石英砂和0.1 mL 2 g·L-1PVP，置于冰上研磨，在4 ℃、10 000 g离心20 min，取上清液测定可溶性POD的活性。将提取完可溶性POD的沉淀物用1%Triton-100和去离子水洗涤。然后在沉淀物中加4 mL 1 mol·L-1NaCl溶液，25 ℃保温过夜，在4 ℃、10 000 g离心20 min。取上清液测定离子键与壁结合的POD活性(iPOD)。用1 mol·L-1NaCl溶液和去无离子水洗涤提取完iPOD的沉淀物。然后在沉淀物中加4 mL的0.1 mol·L-1的醋酸缓冲液(pH 5.6，含0.5%纤维素酶和2.5%果胶酶)，25 ℃保温过夜，离心。取上清液测定共价键与壁结合的POD活性(cPOD)。采用愈创木酚法测定POD活性[11]。定义1个酶活单位(U)为：1 min内能转化1 μmol底物所需要的酶量。

1.5.3 多酚氧化酶(PPO)活性测定 取0.4 g柱花草叶子置于研钵中，加入4 mL预冷的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)，加少量石英砂和0.1 mL 2 g·L-1的PVP，冰上研磨，在4 ℃、10 000 g离心20 min，取上清液用邻苯二酚法[11]来测定PPO酶活性。定义1个酶活单位(U)为:每1 min内A416 nm变化0.1为1 U。

1.5.4 过氧化氢酶(CAT)活性测定 取0.4 g柱花草叶子置于研钵中，加入4 mL预冷的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)，加少量石英沙和0.1 mL 2 g·L-1的PVP，冰上研磨，在4 ℃、10 000 g离心20 min，取上清液用参照Kraus和Fletcher[12]方法来测定CAT酶活性。定义1个酶活单位(U)为：1 min内能转化1 μmol底物所需要的酶量。

1.6 数据分析

采用DPS软件对所测数据统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，对病情指数进行单因素方差分析，并用Duncan法对测定的数据进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 K2HPO4和MeJA的诱抗效果

K2HPO4各浓度处理组与对照组(CK)之间差异显著(P<0.05)，并且各浓度处理之间也差异显著，30 mmol·L-1处理效果最好，诱抗效果达54.40%，10 mmol·L-1次之，50 mmol·L-1效果最差；MeJA处理组相互之间差异显著(P<0.05)，与对照组之间差异也显著，诱导效果最好浓度为0.001 mg·mL-1，诱抗效果达64.84%(表1)。选用诱抗效果最好的浓度30 mmol·L-1K2HPO4和0.001 mg·mL-1MeJA进行防御酶试验。

2.2 可溶性POD活性的变化

0.001 mg·mL-1MeJA处理组的可溶性POD活性随时间逐步上升，而后略有下降(图1)。48 h的可溶性POD活性最高，是同时期CK的1.49倍，并且在48、72和96 h的酶活性都显著高于CK(P<0.05)，但CK的可溶性POD的活性也随时间有所上升，24 h升至最高，此时的酶活性与MeJA处理组无显著差异(P>0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4处理组的可溶性POD活性是先上升后下降再上升的趋势，在48 h显著高于CK，但在24 h显著低于CK。

表1 不同浓度的K2HPO4和MeJA对柱花草炭疽病的诱抗效果Table 1 Effects of induced resistance against infection byC.gloeosporiodesonS.guianesisafter treated by MeJA and K2HPO4at different concentrations

注:同列不同字母表示同一诱导剂不同浓度之间差异显著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters in the same inducer indicate significant difference among different concentrations at 0.05 level.

图1 MeJA和K2HPO4诱抗炭疽菌处理后可溶性过氧化物酶(POD)的变化Fig.1 Changes of soluble POD activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

注：不同小写字母表示相同时间不同处理间的显著性差异(P<0.05)。图2、图3、图4和图5同。

Note: Different lower case letters for the same time show significant differences among different treatments at 0.05 level. The same in Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, and Fig. 5.

2.3 细胞壁共价结合态POD活性变化

0.001 mg·mL-1MeJA处理组的细胞壁共价结合态POD活性随时间先上升后下降，然后又略有上升(图2)。24 h的细胞壁共价结合态POD活性最高，是同时期CK的2.94倍，并且差异显著(P<0.05)，而其他时间点与CK没有显著差异(P>0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4处理的细胞壁结合态POD活性在72 h显著低于CK，其他时间点的酶活性与CK相差不大。

图2 MeJA和K2HPO4诱抗炭疽菌处理后细胞壁共价结合态POD(cPOD)活性变化Fig.2 Changes of cPOD activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

2.4 细胞壁离子结合态POD活性变化

0.001 mg·mL-1MeJA处理组的离子结合态POD活性在24 h升至最高(图3)，是同时期CK的2.65倍，而后略有下降，除0 h外，其他时间点的酶活性都显著高于同时期CK处理组(P<0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4处理组的离子结合态POD酶活性在0 h至72 h与CK都相差不大，没有显著性差异(P>0.05)，在96 h显著高于同时期CK。

图3 MeJA和K2HPO4诱抗炭疽菌处理后细胞壁离子结合态POD(iPOD)活性变化Fig.3 Changes of iPOD activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

2.5 PPO活性的变化

0.001 mg·mL-1MeJA处理柱花草后的PPO活性在48 h升至最高(图4)，显著高于同时期CK(P<0.05)，此时酶活性为CK的2.64倍。30 mmol·L-1K2HPO4处理柱花草后的PPO活性的除24 h显著高于对照，其余与CK无显著差异。此时，CK与K2HPO4处理组的PPO活性都是在24 h升高至最高，K2HPO4处理组的PPO活性是CK的1.50倍。

2.6 CAT活性的变化

0.001 mg·mL-1的MeJA处理柱花草后的CAT活性除了在24和96h比CK略高(图5)，其他时间点的CAT活性都比CK低，并且在72 h显著低于CK(P<0.05)。30 mmol·L-1K2HPO4处理柱花草后的CAT活性先略有下降，而后逐渐升高，72 h升至最高，是同时期CK的1.82倍，随后下降。48和72 h的CAT活性显著高于同时期CK(P<0.05)。

图4 MeJA和K2HPO4诱抗炭疽菌处理后多酚氧化酶活性(PPO)的变化Fig.4 Changes of PPO activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

图5 MeJA和K2HPO4诱抗炭疽菌处理后过氧化氢酶活性的变化(CAT)Fig.5 Changes of CAT activity inS.guianensisafter treated by MeJA and K2HPO4

3 讨论与结论

系统获得抗性是植物抵抗病菌入侵的重要的防御系统，可以通过诱导物诱导植物体产生这种抗性[13]。不同病原菌入侵植物体会产生不同反应，但基本都会经历信号的产生、识别、传递和转化等几个阶段[14]。很多研究表明，茉莉酸(酯)类物质与植物的抗性有密切的关系，可作为内源信号分子参与植物如抗病、抗虫及抗旱等抗逆性反应[15]。Vijayan等[16]报道当病原体入侵拟南芥(Arabidopsisthaliana)后，拟南芥的体内JA含量升高，激活相关的抗病基因表达蛋白以产生抗病作用。磷酸氢二钾也是一种非常重要的无机类化学诱抗剂。张伟丽等[9-10]研究表明,POD、PPO和CAT与柱花草抗炭疽病相关。

在本研究中，MeJA处理柱花草后，在接种病菌24～48 h内，可溶性POD、共价结合态POD(cPOD)和离子结合态POD(iPOD)的活性都大幅度增加，达到最高，而且显著高于同时期的对照组(P<0.05)。MeJA处理柱花草接种病菌后，POD受到较早时间的诱导使植物体进入防御阶段，因此降低发病率。也说明了柱花草抗病性与POD有一定的关系，与向妙莲等[17]研究的结果相符合。K2HPO4处理柱花草后，接种病菌48 h，可溶性POD达到最高，但cPOD和iPOD却与对照相差不大。K2HPO4对可溶性POD的诱导作用比cPOD和iPOD好。

PPO普遍存在于植物中，能够将酚类化合物催化醌类化合物，而醌类化合物对入侵植物体的病菌有毒害作用，从而保护植物[18]。MeJA和K2HPO4处理柱花草后，在接种病菌后，前者48 h PPO都达到了最高值，而后者在24 h达到最高，而且显著高于对照组(P<0.05)。但K2HPO4诱导PPO的时间更短，活性更高。因此，说明两者在接种早期都提高了PPO的活性，进而抵御了炭疽菌对柱花草的侵染，提高了植株的抗病性。

植物体内的CAT主要作用是催化H2O2，既可以作为信号因子诱导植物抗病反应，也可以起到直接病菌作用，CAT的活性与H2O2成反比，并且过多的H2O2会对植物体造成伤害[19]。K2HPO4处理柱花草接种病菌后，CAT活性先降低，从24～72 h之间持续上升，过程是先积累H2O2防御病菌入侵，然后CAT活性升高催化较多的H2O2，至96 h下降，防止植物体受伤害。而MeJA处理组刚好相反，在24 h CAT活性先升高，后面的其他都时间降低，表现为较长时间段内积累H2O2防御病菌入侵。结果说明这两种诱导物诱导CAT的反应机制不同。

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(责任编辑 张瑾)

The resistance ofStylosanthesguianesistoColletotrichumgloeosporioidesinduced by methyl jasmonate and K2HPO4

WU Kang-rong1, LIU Feng-min2, ZHANG Wei-li1, CHEN Zi-jian1, XU Dai-qi1, Li Zhi-hui1, LUO Xi-mei1, LIN Guo-sen1
(1.College of Life Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2.Teaching and Science Research Base, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

The effects of methyl jasmonate (MeJA) and K2HPO4on induced resistance ofStylosanthesguianesiscv CIAT184 toColletotrichumgloeosporioideswere studied. The results indicated that the disease indexes ofS.guianesisdecreased significantly (P<0.05) by treatments of MeJA with concentration ranged from 0.001 to 0.1 mg·mL-1and K2HPO4with concentration ranged from 10～50 mmol·L-1. The optimal concentration of MeJA and K2HPO4treatment was 0.001 mg·mL-1and 30 mmol·L-1, respectively, which had induced effects of 64.84% and 54.40%, respective. The activities of POD and PPO in plants treated with 0.001 mg·mL-1MeJA increased and reached maximum at 48 hour after inoculation, which were significantly (P<0.05) higher than those in control plant without MeJA. The activities of POD and PPO in plants treated with 30 mmol·L-1K2HPO4increased and reached maximum at 48 hour and 24 hour after inoculation, respectively, which were significantly (P<0.05) higher than those in control plants without K2HPO4. These results suggested that MeJA and K2HPO4increased the activities of antioxidant enzymes like POD and PPO in the early stage after inoculation to improve the resistance ofS.guianesisto anthracnose after inoculation. The activities of CAT in plants treated with 30 mmol·L-1K2HPO4increased from 48 hour to 72 hour after inoculation, which were significantly (P<0.05) higher than those in control plants without K2HPO4. However, the activities of CAT in plants treated with 0.001 mg·mL-1MeJA were similar with those in control plants without MeJA excepted with the former one was significantly (P<0.05) lower than later one at 72 hour after inoculation. These results indicated that the induced effects of these two chemicals on the disease resistance ofS.guianesistoC.gloeosporioideswere related with the activities and induced time of POD, PPO and CAT.

Stylosanthesguianesis;Colletotrichumgloeosporioides; methyl jasmonate; K2HPO4; induced resistance

ZHANG Wei-li E-mail:zhangweili7218@163.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0410

2014-09-11 接受日期：2015-03-03

广东省自然科学基金项目(S2011010000435)

伍康荣(1988-)，男，广东湛江人，在读硕士生，研究方向为植物抗病生理及分子机理。E-mail:wkrrong@163.com

张伟丽(1969-)，女，河北乐亭人，教授，硕导，博士，研究方向为植物抗病生理及分子机理研究。E-mail：zhangweili7218@163.com

S435.4

A

1001-0629(2015)07-1124-06*

伍康荣,刘凤民,张伟丽,陈梓健,许戴奇,黎志辉,罗喜梅,林国森.茉莉酸甲酯和磷酸氢二钾诱导柱花草对炭疽病的抗性[J].草业科学,2015,32(7):1124-1129.

WU Kang-rong,LIU Feng-min,ZHANG Wei-li,CHEN Zi-jian,XU Dai-qi,Li Zhi-hui,LUO Xi-mei,LIN Guo-sen.The resistance ofStylosanthesguianesistoColletotrichumgloeosporioidesinduced by methyl jasmonate and K2HPO4[J].Pratacultural Science,2015,32(7)：1124-1129.