草酸对金铁锁悬浮培养细胞的影响

潘 苗 苗，　杨 雨 迎，　张 　 健，　金 朝 霞，　张 孟 夏，　张 宗 申

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )



草酸对金铁锁悬浮培养细胞的影响

潘 苗 苗，杨 雨 迎，张 健，金 朝 霞，张 孟 夏，张 宗 申

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:研究了黑暗和光照下草酸对金铁锁悬浮细胞的生理影响。结果表明，外源草酸会导致金铁锁悬浮细胞膜透性增加，变化幅度与使用的草酸浓度有关系；草酸处理还会引起悬浮细胞中过氧化氢酶(CAT)活性和皂苷含量的增加，0.1 mmol/L草酸是最佳诱导浓度。对金铁锁悬浮细胞提供光照(3 000 lx)，可以长时间保持细胞中CAT活性并有利于皂苷积累。草酸具有一定的促进金铁锁悬浮细胞积累皂苷的作用，一定的光照有利于草酸的诱导作用。

关键词:金铁锁；悬浮细胞；草酸；光培养

0引言

金铁锁属于石竹科(Caryophyllaceae)金铁锁属(Psammosilene)，为单属单种的多年生草本植物，其根是“云南白药”等多个著名中成药的主要原料。主要化学成分包括三萜皂苷、环肽及内酰胺等，其中起镇痛和抑菌作用的成分是皂苷类物质[1]。由于金铁锁在自然条件下生长周期长(3～4年)，以及环境恶化和市场需求增加等原因，金铁锁野生资源数量急剧下降，成为《中国植物红皮书》中的国家二级重点保护的珍稀濒危物种[2-3]。利用细胞培养等技术生产金铁锁天然产物，具有不受季节、土地和环境等因素限制的优势，是解决金铁锁药用资源匮乏问题的途径之一。

研究表明，草酸是一种有效的非生物诱导子，可以改变植物细胞的生理生化代谢和细胞生长发育状态，提高植物细胞的抗逆性[4]。张健等[5]发现草酸处理金铁锁悬浮细胞能够引起胞内过氧化物酶活性和细胞壁木质素沉积的改变。草酸还可能通过启动胞内Ca2+信号和激活关键酶的活性等机制促进丹参、人参及南方红豆杉等细胞中的次生代谢产物积累[6-7]。

光作为影响植物生长和发育的重要环境因子之一,在植物的形态建成和发育分化过程中起着重要的作用。陈顺钦等[8]发现光照可以刺激黄芩相关基因的表达从而提高黄芩有效成分的含量。本实验研究了黑暗和光照条件下草酸处理对金铁锁悬浮细胞的影响，探讨光在草酸诱导金铁锁悬浮细胞变化过程中的作用，为揭示草酸-植物细胞互作机理、筛选高效诱导子以及优化金铁锁悬浮细胞培养工艺提供依据。

1材料与方法

1.1材料

在无菌条件下，挑选质地疏松、淡黄色或乳白色的金铁锁愈伤组织，按照愈伤组织质量与培养液体积1∶10(g/mL)建立MS液体培养体系，在25 ℃、110 r/min摇床中暗培养[5]。

1.2方法

1.2.1外源草酸的处理

取一定体积的草酸溶液(0.1 mol/L)，用NaOH调至pH 5.9，加入液体培养基中，灭菌。将细胞继代于不同浓度草酸的培养基中培养。

1.2.2细胞活力测定

使用TTC染色法测定细胞活力[5]。

1.2.3细胞膜渗透率的测定

采用电导率法测定细胞膜渗透率。将相同的悬浮培养细胞均分成2份，分别加入等体积的培养液L0(原培养液)与L1(含草酸)，经相同时间处理后测定电导率，分别为C0和C1。将L1用保鲜膜封口，沸水浴3 min后冷却至室温，测定其电导率为Ct。按照公式η=(C1-C0)/(Ct-C0)计算草酸处理后引起的细胞膜渗透率变化[9]。

1.2.4细胞中过氧化氢酶(CAT)活力测定

取0.1 g鲜细胞，用3 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L，pH 7.8)悬浮后添加1 mL 0.1 mol/L H2O2溶液，立即计时，每分钟测定一次λ240处的吸光度，共测3次，分别为A1、A2、A3。将细胞沸水浴处理10 min后重复操作，测得结果为A0作为对照[10]。以ΔA240表示CAT活力变化，计算公式为：ΔA240=A0-(A1+A2+A3)/3。

1.2.5金铁锁皂苷的提取及测定

将金铁锁悬浮细胞样品离心，去除培养液，以去离子水洗涤细胞3次，干燥，称重，75%乙醇回流提取3次，合并提取液，过滤，滤液蒸干得到干膏，加2倍体积水溶解干膏，然后用等体积石油醚萃取3次，保留水层，再用等体积水饱和正丁醇萃取3次，保留正丁醇层，蒸发至干膏，减压干燥至恒重，即得到金铁锁粗总皂苷。本实验选择人参皂苷Re为对照品,采用香草醛-高氯酸比色法测定金铁锁总苷含量[11]。

2结果与结论

2.1草酸对悬浮细胞膜透性的影响

2.1.1草酸浓度对细胞膜渗透率的影响

在暗培养条件下，用不同浓度草酸(0.5，1，5，10，15，20，25和30 mmol/L)处理金铁锁悬浮细胞8 h后，测定细胞膜渗透率，结果如图1所示。从图1可以看出，草酸浓度低于1 mmol/L时，细胞膜渗透率变化不明显；当草酸浓度高于5 mmol/L 时，细胞膜渗透率明显增加；当草酸浓度达到20 mmol/L时，细胞膜渗透率达到65%，继续提高草酸浓度细胞膜渗透率增幅不大。

图1草酸浓度对金铁锁悬浮细胞膜透性的影响

Fig.1EffectsofoxalicacidconcentrationonthemembranepermeabilityofP. tunicoidessuspensioncells

细胞膜是胞内外物质交换的界膜，其完整性对维持细胞的正常生理活动具有重要意义。因此，本实验利用细胞膜透性的变化作为生理评价指标，反映草酸对金铁锁悬浮细胞膜的影响。当草酸浓度为5mmol/L以上时，细胞膜渗透率开始增大，说明草酸开始改变细胞膜半透性，引起胞内离子外渗；当草酸浓度达到20mmol/L以上，电导率急剧升高，表明电解质大量释放到胞外，细胞膜的完整性受到严重影响。因此，在金铁锁悬浮细胞培养中,草酸作为诱导因子的使用浓度不应超过5mmol/L。

2.1.2草酸处理时间对细胞膜渗透率的影响

在暗培养条件下，选择不同浓度的草酸处理金铁锁悬浮细胞，每隔4h测一次悬浮细胞培养基的电导率，观察膜透性与草酸处理时间的关系。根据“2.1.1”的实验结果，分别选取草酸处理浓度为1和5mmol/L，测定2种浓度在不同处理时间后的细胞渗透率变化，结果如图2所示。

图2草酸处理时间对金铁锁悬浮细胞膜透性的影响

Fig.2EffectsofprocessingtimeofoxalicacidonthemembranepermeabilityofP. tunicoidessuspensionculturedcells

由图2可以看出，两种浓度草酸处理后，细胞膜渗透率都是随时间延长而增加，其中1mmol/L草酸处理后，细胞膜渗透率28h后保持稳定；5mmol/L草酸处理的细胞膜渗透率在16h时就达到最大值。该结果表明草酸对悬浮细胞膜透性的影响，具有浓度和时间依赖性。

2.2草酸对悬浮细胞CAT活性的影响

2.2.1草酸浓度对悬浮细胞CAT活性的影响

在暗培养条件下，用不同浓度的草酸(0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6，0.8和1.0mmol/L)处理金铁锁悬浮细胞16h后，测定细胞中CAT活性和细胞活力变化，结果如图3所示。草酸浓度在0～0.2mmol/L时，CAT活性显著增加，且细胞活力逐渐增强， 0.2mmol/L草酸处理的细胞活力较对照增加46.08%；当草酸浓度在0.2～0.5mmol/L范围时，尽管CAT活性逐渐下降，但细胞活力几乎保持不变；当草酸浓度达到0.5mmol/L以上时，随着草酸浓度的升高，CAT活性和细胞活力都明显降低。

图3草酸浓度对金铁锁悬浮细胞CAT活力和细胞活性的影响

Fig.3EffectsofoxalicacidconcentrationontheCATactivityandcellvitalityofP. tunicoidessuspensioncells

由图3可知，CAT的酶活力及细胞活力与草酸浓度呈先增大后减少的关系，这是植物正常的生理反应，即当细胞开始受到胁迫时，细胞相关保护酶的酶活力有一定程度的增加；当草酸浓度过高超过了植物承受的阈值时，则相应保护酶的酶活力会逐渐降低，进而导致植物细胞受到伤害或死亡，与“2.1.1”结果及李岩[13]的结论一致。

2.2.2草酸处理时间对悬浮细胞CAT活性的影响

根据“2.2.1”的结果，选择在暗培养条件下用0.1 mmol/L草酸处理金铁锁悬浮细胞，每隔4 h测定一次细胞CAT活性和细胞活力，结果如图4所示。从图4可以看出，在处理的0～12 h，CAT活性逐渐增长并在12 h达到最大值，比开始时增加113.39%，之后酶活力开始下降；而在酶活力变化过程中，细胞活力并没有随草酸处理时间的延长而下降，反而有上升的趋势。

图4草酸处理时间对金铁锁悬浮细胞CAT活性和细胞活力的影响

Fig.4EffectsofdifferenttreatmenttimeofoxalicacidonCATactivityandcellvitalityofP. tunicoidessuspensioncells

随着草酸处理时间的延长，细胞CAT活力呈现先增大后降低的趋势；与之相反，细胞活力表现出轻微上升的趋势，说明此时细胞处于正常的生长状态。推测原因可能是CAT在开始受到草酸胁迫时，酶活力不断增大；当胁迫持续一段时间后，酶活力达到最大值，而细胞活力逐渐降低到静态水平，即反应结束。说明当低水平草酸浓度处理植物细胞后，会刺激植物细胞的抗逆反应，通过细胞CAT活性的变化以应对环境胁迫[12]。

2.3草酸对悬浮细胞皂苷含量的影响

2.3.1草酸处理浓度对细胞皂苷积累的影响

根据“2.1”和“2.2”的结果，在培养条件下用不同浓度草酸处理金铁锁悬浮细胞，15d后测定细胞中总皂苷含量的变化，结果见表1。表1结果表明，皂苷含量并不随着草酸处理浓度的增加而升高，0.1mmol/L草酸处理的细胞中皂苷含量最大，比对照组增加了10%；当草酸浓度大于0.1 mmol/L时，随着草酸浓度的增大，皂苷含量逐渐降低。这可能是由于高浓度草酸处理严重伤害了细胞，甚至引起细胞的程序化死亡，反而导致细胞合成皂苷的能力下降[13]。

表1草酸处理浓度对金铁锁悬浮细胞皂苷含量影响

Tab.1EffectsofoxalicacidconcentrationonthesaponincontentofP. tunicoidessuspensioncells

c/(mmol·L-1)w/%0(对照)0.352±0.00620.050.368±0.00220.10.386±0.00230.50.369±0.00441.00.357±0.00295.00.349±0.0014

2.3.2草酸处理时间对细胞皂苷含量的影响

选择0.1 mmol/L草酸处理金铁锁悬浮细胞，在指定时间内测定皂苷含量，以未经草酸处理的样品为对照，结果如表2所示。

表2草酸处理时间对金铁锁悬浮细胞皂苷含量影响

Tab.2EffectsofdifferenttimeofoxalicacidtreatmentonthesaponincontentofP. tunicoidessuspensioncells

处理时间/dw/%对照组0.1mmol/L0(对照)0.354±0.00220.355±0.003170.357±0.00280.377±0.0026140.359±0.00170.386±0.0038210.351±0.00210.386±0.0046280.357±0.00190.386±0.0025

表2表明，虽然草酸处理的细胞中皂苷含量增加较快，但当处理时间超过14 d后，皂苷含量几乎没有变化，可能是由于细胞衰老、培养基pH下降等原因，导致细胞合成皂苷速度下降并停止，使细胞中皂苷含量达到动态平衡并缓慢下降。

2.4光照对草酸处理细胞的CAT酶活力的影响

选取0.1 mmol/L草酸处理悬浮细胞后，分别在光照和黑暗下培养，其中光照的光强为3 000 lx，光照时间24 h/d。CAT活性和细胞活力的变化如图5所示。由图5可以看出，暗培养与光照条件下的金铁锁悬浮细胞的CAT活性都是呈现先增加再降低的趋势，二者的酶活力的最大值分别出现在16和24 h。16 h内，暗培养与光培养下细胞的CAT吸光度每小时分别提高1.67×10-2和1.16×10-2；28～32h内暗培养与光培养下细胞的CAT酶活力每小时分别降低0.79×10-2和0.57×10-2。结果表明，光照培养可以让悬浮细胞CAT活力更长时间地维持高水平状态，从而有利于细胞对活性氧的清除作用。

图5光照下金铁锁悬浮细胞CAT活性和细胞活力与草酸处理时间的关系

Fig.5EffectofdifferenttreatmenttimeofoxalicacidonCATactivityandcellvitalityofP. tunicoidessuspensioncellsunderillumination

2.5光照对草酸刺激悬浮细胞皂苷合成的影响

在与“2.4”同样反应条件下，在指定时间内测定皂苷含量变化，结果见表3。

表3光照对草酸刺激金铁锁悬浮细胞皂苷合成的影响

Tab.3EffectsofilluminationonthesynthesisofsaponinsofP. tunicoidessuspensioncellsinducedbyoxalicacid

处理时间/dw/%暗培养光培养0(对照)0.355±0.00310.352±0.002470.377±0.00260.355±0.0042140.386±0.00380.363±0.0025210.386±0.00460.362±0.0035280.386±0.00250.373±0.0023

表3结果表明，光照条件下，虽然细胞中皂苷含量增加缓慢，但保持持续增长；而在暗培养下皂苷含量几乎不变，光照下细胞中皂苷含量依然稳定增长。结果说明，光照有利于草酸诱导的金铁锁细胞中皂苷积累。

3讨论

草酸是植物细胞产生的简单二元酸，也是植物细胞-微生物互作时病原菌分泌的重要致病因子[14]，有研究表明它还是一种重要的非生物激发子，可以诱导植物中一些与防御反应相关酶活性的提高[15]，或能增强辣椒叶片的抗热性[16]；HUDGINS等[17]对46种松科植物研究发现，草酸钙在植物细胞中可以形成一种保护防御膜，能够有效地阻挡昆虫对植物的损害。GUO等[18]研究发现，草酸盐生物合成能够增强植物细胞内的L-半乳糖酸-γ-内酯含量，有效提高植物非生物胁迫耐受。

本研究发现，草酸使金铁锁悬浮细胞的膜透性增加，这表明在植物细胞培养中添加草酸对细胞造成一定影响；同时，草酸处理会提高悬浮细胞的CAT酶活和细胞活力。皂苷是金铁锁的次级代谢产物，是金铁锁的活性成分之一。一定浓度的草酸处理可以促进金铁锁悬浮细胞皂苷积累，说明草酸与细胞的相互作用可以促进细胞的次级代谢，但如果把草酸应用于以植物细胞培养生产次级代谢物中，应该考虑草酸浓度、时间等方面的因素，否则细胞衰老死亡的速度过快，反而会影响植物细胞培养成本。

金铁锁悬浮细胞培养一般在暗培养中进行，但本实验通过光、暗培养比较，发现光照对草酸处理后的细胞CAT活性有较大影响，光培养下细胞经草酸处理后其CAT活性增加速率较暗培养下慢，但是CAT活性能够长时间地维持高活性，从而有利于细胞的抗逆作用；尽管光培养下的悬浮细胞皂苷积累稍微低于暗培养下的悬浮细胞，但由于光培养下的悬浮细胞生长时间持久，总皂苷产量反而增加。综上，在使用草酸作为诱导子作用于金铁锁悬浮细胞时，可以考虑适当提供光照，一方面保护细胞免受或减轻伤害，还可以提高植物细胞的次生代谢水平。

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Effects of oxalic acid on suspension culture cells ofPsammosilenetunicoides

PANMiaomiao,YANGYuying,ZHANGJian,JINZhaoxia,

ZHANGMengxia,ZHANGZongshen

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:The effects of oxalic acid on the physiological responses of Psammosilene tunicoides suspension cells under dark and illumination were investigated. The results showed that oxalic acid could increase cell membrane permeability, which was of exogenous oxalic acid concentration-dependent. Oxalic acid could also increase the CAT activity and saponin content in cellular. The CAT activity in suspension cells could be maintained for a long time when the oxalic acid-treated suspension cells were exposed on 3 000 lx light strength. So the addition of oxalic acid could improve the accumulation of saponins in the suspension cells of P. tunicoides, and illumination could facilitate the function of oxalic acid as an elicitor in this process.

Key words:Psammosilene tunicoides; suspension cells; oxalic acid; illumination

文章编号:1674-1404(2015)06-0401-03

通信作者：

作者简介:潘苗苗(1990-)，男，硕士研究生；张宗申(1968-)，男，教授.

基金项目:科技部中小企技术创新基金资助项目(12C26214104279).

收稿日期:2015-01-06.

中图分类号:Q942.5

文献标志码:A