与犬乳腺癌相关标志物的研究现状

马倩若，林德贵（中国农业大学动物医学院，北京　100193）

与犬乳腺癌相关标志物的研究现状

马倩若，林德贵*
（中国农业大学动物医学院，北京100193）

摘要：随着分子生物学的不断发展，肿瘤标志物的检测越来越广泛的用于犬乳腺癌的早期诊断和治疗中。本文将对与犬乳腺癌相关标志物的研究现状做一简要介绍，为犬乳腺癌的早期诊断，判断预后和指导治疗提供一定的参考依据。

关键词：犬乳腺癌；肿瘤；标志物；早期诊断

众所周知，乳腺癌的早期诊断是提高其治愈率的关键。目前人医临床为提高肿瘤的早期诊断率，应用多种检查手段，包括X线检查、超声检查、CT检查、磁共振检查、内腔镜检查等。这些检查手段能够从不同方面对肿瘤进行诊断，但各有其局限性。许多与肿瘤相关的生化，免疫标志物的不断被发现，为肿瘤的早期检测提供了可能途径。肿瘤标志物（tumor marker,TM）的检测对肿瘤辅助诊断及判断预后及指导治疗都具有重要意义。随着分子生物学的不断进展，越来越多的特异性乳腺肿瘤标志物被发现和应用，为乳腺肿瘤的早期诊断，判断预后及指导治疗提供了一个新的途径。

肿瘤标志物（Tumor marker，TM），是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的、或者由机体对肿瘤细胞的反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素及癌基因产物等。通过检测肿瘤标志物的表达量，不仅可以对肿瘤的良恶性进行鉴别诊断，而且有助于判断预后和指导治疗[2]。由于肿瘤的异质性，即肿瘤细胞生物学特性具有复杂性和多态性，表现为癌变后不同种肿瘤病理类型的差异、同种病理类型的肿瘤细胞的异质性、肿瘤细胞表型的差异等。因此同种肿瘤组织可存在一种或多种标志物，而不同肿瘤组织既可有相同肿瘤标志物，也可有不同肿瘤标志物。因此，可选用多种标志物进行联合检测，提高肿瘤标志物检测的阳性率及应用价值[3]。

乳腺肿瘤是母犬最常发的肿瘤性疾病，其中约40%～50%被诊断为恶性肿瘤。犬的乳腺肿瘤与人的乳腺肿瘤在许多方面有着类似的特征，如组织学，生物学等，所以，犬的乳腺肿瘤是研究人乳腺肿瘤的理想模型。目前，乳腺肿瘤标志物的研究已取得一定进展，并广泛用于人乳腺癌的术前诊断、指导治疗和预后判断。但在兽医临床领域中，生物标志物也在逐渐被应用，但远落后于人医，未来还有很长的路要走，本文将对与犬乳腺癌相关标志物的研究现状做一简要介绍，为犬乳腺癌的早期诊断，判断预后和指导治疗提供一定的参考依据。

1　Top2A(拓扑异构酶II)

DNA拓扑异构酶是具有调节DNA功能的核酶，根据其催化机制，反应条件，理化性质等差异可分为拓扑异构酶I和拓扑异构酶II。拓扑异构酶II是一种编码拓扑异物酶的编码基因，位于17号染色体，拓扑异构酶II具有两种同工酶，即a和β同工酶，a亚基具有磷酸二酯酶活性，β亚基具有DNA依赖的ATP酶活性。研究表明Top2A蛋白的高表达提示肿瘤增殖率较高，恶性程度较高。在乳腺癌的治疗中，Top2A是乳腺肿瘤药物蒽环类药物的作用靶点[4]。据报道，Top2A表达高低与肿瘤耐药成反比，因此，Top2A是蒽环类新辅助化疗的预测因子[5]。近年大量文献报道，Top2A阳性患者与HER-2阴性患者，对蒽环类化疗无效。而HER-2阳性患者相反。另有研究报道[6]，Her-2阴性患者且Top2A高表达，同样对蒽环类化疗有效。但部分学者认为，Top2A对蒽环类化疗的作用，与HER-2基因的表达没有直接的相关性。Top2A联合Her-2或其他标志物的检测，可判断患者对蒽环类药物的疗效，并且是目前的研究热点[7]。

2　HER-2（human eidermal growth factor receptor 2　,人表皮生长因子受体2　）

HER-2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，结构上由胞外段，跨膜区域段和胞内的络氨酸激酶区域段组成[8]。与细胞的增殖，死亡，分化有关。在人乳腺癌的形成和发展过程中，表皮生长因子受体酪氨酸激酶介导的细胞生长信号通路起着重要作用[9]。目前已有广泛研究表明，30%的人类肿瘤中存在HER-2基因的过表达，包括乳腺癌等，在人乳腺癌中的过表达对于评估预后，预测放化疗具有重大意义[10]，并且可以作为判断乳腺癌预后和化疗疗效的重要指标之一。另有研究，HER-2基因的过表达与人乳腺癌患者的预后不良有关[11]。最近发现，在乳腺癌患者唾液中也检测到HER-2的存在，其水平远远超过乳腺早期病变的患者，并进一步发现唾液中HER-2水平与血清中HER-2水平有着同等的临床意义[12]。在兽医领域中，研究表明，犬恶性乳腺癌有HER-2基因扩增或蛋白的过表达[13]，但在正常乳腺组织或良性肿瘤中尚未发现[14]。其在犬恶性乳腺癌中的过表达率与人乳腺癌相似（20%～30%）。研究显示，HER-2的过表达与患犬预后差的相关指征有关[15]，但HER-2的预后意义仍需大量研究。目前广泛用于临床检测血清中HER-2的方法为免疫组织化学和荧光原位杂交法，但是存在很多缺点，即不能随时监测患者的病情，并具有创伤性，所以通过检测血清中HER-2水平来判断患犬病情，也将是兽医临床的发展趋势。

3　p53

p53为编码调节细胞周期蛋白的基因，具有抑制肿瘤发生的功能，几乎存在于所有肿瘤细胞中。p53基因分为野生型和突变型，前者为抑癌基因，后者为致癌基因。正常情况下，多数肿瘤细胞中的p53不被激活；当细胞受到外来刺激时，p53表达将增加。野生型p53在肿瘤发生发展过程中起抑制作用[16]，通过调控细胞周期，细胞凋亡，DNA修复，血管生成等。突变型p53作为致癌基因，能促进细胞恶性转化。突变型p53可抑制野生型p53的活性，能促进细胞转化，最终导致肿瘤的发生。

人的p53和犬的p53同源性达90%以上[17]。p53在正常细胞中的表达量较低，而在肿瘤细胞中的表达显著上调[18]。研究表明，p53在肿瘤组织中的高表达提示，p53是判断肿瘤预后的良好指标[19]。另有研究显示[20]p53蛋白在正常人乳腺组织中不表达，但在乳腺癌组织中的阳性表达率为65.63%，其阳性率随着组织学分级的增高而逐渐增高，表明p53蛋白在人乳腺癌的发生发展中起重要调控作用，可作为预测癌细胞是否发生转移的重要指标。最近一项[21]关于检测p53基因诊断犬乳腺恶性肿瘤的初步研究中，发现p53基因在恶性肿瘤组织中的表达量明显增高，并且与肿瘤恶性程度呈正相关，而在良性肿瘤组织中的表达极低，结果提示通过检测p53基因的表达量，可判断犬乳腺肿瘤的恶性程度，并且可作为判断预后的良好指标之一。

目前，以p53为靶点的基因治疗成为肿瘤生物治疗的热点，而在犬乳腺癌的诊断和治疗中，具有广阔前景。

4　PCNA（ProliferatingCellNuclearAntigen，增殖细胞核抗原）

PCNA是核内蛋白质,参与调解DNA的合成,是调节细胞周期的重要蛋白,在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA蛋白阳性率与癌组织分级与肿瘤恶性程度呈正相关。研究结果表明,PCNA的表达越高,其肿瘤细胞的恶性度越高，分化差。PCNA表达与临床分期、淋巴结转移、肿瘤复发、远处转移呈正相关,是反应细胞恶性程度及判断预后的良好指标。对肿瘤良恶性的鉴别诊断具有应用价值。

5　ki-67（增殖细胞核抗原）

Ki-67是与细胞增殖相关的细胞核抗原，是最常用的衡量肿瘤增殖指数（Proliferation Index）的标记物，反映肿瘤细胞的增殖情况。Ki-67表达于所有活跃的细胞周期阶段，在细胞核内的定位随细胞周期的改变而改变[22]。Ki-67在G1后期开始出现，其表达量较低，其表达逐渐升高是在S和G2期，M期达到最高峰，随后其表达迅速下降[23]。Ki-67对细胞增殖起重要作用，对人乳腺肿瘤疾病的诊断及预测有重要的帮助，研究显示ki-67是Ⅰ期乳腺癌的特异性标记物，且ki-67≥10%可以作为Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌的分层指标[24]。目前，ki-67作为一个预测指标广泛的用于乳腺癌的新辅助治疗中[25-29]。研究表明Ki-67在多种恶性实体肿瘤中的表达显著增高，并且与肿瘤的恶性程度，转移和预后相关[30]。研究显示Ki-67在犬乳腺肿瘤中的表达同样显著增高，与人乳腺肿瘤相似[31]，提示Ki-67对犬乳腺肿瘤的预后判断具有一定诊断价值。最近研究表明[32]Ki-67可作为判断犬恶性乳腺癌的一个独立预后指标。且越来越多的证据显示Ki-67有望成为兽医临床肿瘤的诊断和预后的分子标记物。

6　糖链抗原标志物（CA15-3）

糖链抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3,CA15-3),是目前乳腺癌较为特异的标志物之一。作为Mucin 1基因的产物，为跨膜糖蛋白分子，在正常情况下仅表达在腺上皮细胞的顶端,但在许多腺癌中表达过度，即血清中CAl5-3的含量升高[33-34]。其原因为细胞骨架发生破坏，CA15-3从细胞表面脱落进入血液循环。CA15-3有两个可识别的抗原表位，分别源于肝转移乳腺癌细胞膜制成的单克隆抗体DF3，和人乳脂肪球膜上糖蛋白制成的单克隆抗体115d8[35-36]。其作为抗粘附分子，能促进恶性肿瘤细胞脱落，并增加其转移侵袭能力[37]。

目前，CA15-3是人乳腺癌使用最广泛的血清生化标志物。在血清中的高表达与肿瘤大小，疾病分期，淋巴结转移和患者预后不良有关[38-39]。除存在于乳腺癌外，还广泛存在于其他上皮性肿瘤细胞中，所以临床上常联合其他血清标志物，用于临床诊断，辅助治疗和预后评估。

在兽医领域中，仅有1篇文献描述血清标志物CA15-3在犬乳腺肿瘤领域应用的可能性[40]，但最近已取得一定进展，相关研究表明CA15-3在犬乳腺癌中的表达升高，并与人乳腺癌的研究结果类似[41]，显然，此项研究仅仅是血清肿瘤标志物在犬乳腺癌应用的开始，其临床应用价值，仍需进一步研究。

7　E-cadherin

细胞粘附分子在肿瘤的发生发展、侵袭和转移中起重要作用，是介导细胞与细胞之间粘附作用的糖蛋白。E-cadherin是钙粘蛋白家族的主要成员之一，是钙调节重要的细胞粘附分子，作为跨膜蛋白，维护正常细胞间的连接，使上皮之间的黏附功能增强，当细胞间的连接破坏，即E-cadherin的表达降低或丧失，会导致肿瘤细胞的浸润和转移，促使乳腺癌的发生。在人乳腺癌和前列腺癌中，E-cadherin和betacatenin的缺失与预后差相关，E-cadherin可作为判断肿瘤预后的指标之一。E-cadherin的表达随着肿瘤恶性程度的增加而不断下调，提示与恶性肿瘤的分化和侵袭转移相关[42]。在犬乳腺肿瘤中[43]，研究显示E-cadherin在良恶性犬乳腺肿瘤中均有表达，但各种组织中E-cadherin的表达率有差异，推测E-cadherin在犬乳腺肿瘤的发生发展中可能起一定作用。

8　结　语

以上所讨论的几个标志物，具有潜在的价值，用于犬乳腺肿瘤的早期判断，预后评估以及对治疗反应的预测。然而，肿瘤标志物的临床应用存在许多问题：（1）肿瘤标志物检测的标准化问题，不同试剂生产厂家由于使用的抗体不同，对同一肿瘤标志物的含量测定可能会有所不同，因此，为保证检测结果的一致性，肿瘤标志物检测的标准化极为必要。（2）很多因素如肿瘤良性病变等，会使其标志物的表达升高，从而造成肿瘤标志物的假阳性，那么如何鉴别“真正”的阳性，需要进行准确的判断。（3）当肿瘤组织受到破坏或肿瘤坏死时，会导致某些肿瘤标志物的产生增加，从而影响肿瘤标志物的测定；

目前，在犬乳腺肿瘤中，没有发现理想的分子标志物，因此，应结合临床病理特征与组织学分级，对犬乳腺肿瘤的诊断和预后更可靠。总之，犬乳腺肿瘤标志物的研究已取得一定研究进展，目前尚未发现理想的生物标记物，多种犬乳腺癌生物标志物的联合检测，仍是目前和未来发展的趋势。

参考文献：

[1]Mirabelli P,Incoronato M.Usefulness of traditional serum biomarkers for management of breast cancer patients[J].Biomed Res Int.2013;2013:685641.

[2]中华医学会检验医学分会肿瘤标志物专家委员会.肿瘤标志物[J].中华检验医学杂志，2004，（27）：393.

[3]禹新华,孙静.肿瘤标志物联合检测在消化系统肿瘤诊断中的应用[J].检验医学与临床,2007,4(4):271-272.

[4]Wang J,XuB,YuanP,et al.Top2A amplification in breast cancer is a predictive marker of anthracyclinebased neoadjuvant chemotherapy efficacy,2012,135(2):531-7.

[5]Romero A,CaldesT,Diaz-Rubio E,etal.Topoisomerase 2 alpha:a real predictor of anthracyclineefficacy. [J].Clin Transl Oncol,2012,14(3):163-8.

[6]BrünnerN,EjlertsenB,GehrmannM,et al,Mouridsen Prediction of responsiveness to adjuvant anthracyclines in high-risk breast cancer patients[C].ASCO Meeting Abstracts.2009，27(5):597.

[7]Gianni L,NortonL,WolmarkN,etal.Role of Anthracyclines in the Treatment of Early Breast Cancer Clin［J］. Oncol,2009,27(28):4798-4808.

[8]IshikauaT,IchikawaY,shimizuD,etal.The role of Her-2 in breast cancer[J].J Surq Sci,2014,2(1):4-9.

[9]李哲，袁守军.表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用[J].中国临床药理学与治疗学, 2004，9(4):361-364.

[10]罗玉凤，曹金玲，张静，等.HER-2免疫组化染色方法及注意事项[J].诊断病理学杂志,2011，（3）:239.

[11]Jaclyn A.freudenberg,Qiang Wang,Makoto Katsumata,etal.The role of HER-2 in early breast cancer metastasis and the orrgins of resistance to HER-2-targeted therapies[J].Experimental and Molecular Pathology,2009，（87）:1-11.

[12]AlotaibiAM,AlqarniMA,AlnobiA,etal.Human epidermal growth factor receptor 2 in salivary gland carcinomas:a review of literature[J].J ClinDiagn Res,2015,9(1):4-8.

[13]姚薇,杨超,梁伟峰，等.44例犬乳腺肿瘤的病理学分析及p53和HER-2的蛋白表达[J].中国兽医杂志,2015,51(6):82-83.

[14]Chantal Tse,Anne-Sophie Gauchez,WilliamJacot,et al.HER-2 shedding and serum HER-2 extracellulardomain:Biology and clinical utility in breast cancer[J].Cancer Treatment Reviews,2012,（38）:133-142.

[15]J.Martin de lasMulas,J.Ordas,Y.Millan,etal.Oncogene HER-2 in canine mammary gland carcinomas. Animmunohistochemical and chromogenic in situ hybridization study[J].Breast Cancer Research and Treatment,2003,（80）:363-367.

[16]Stiewe T.The p53 family in diferentiation and tumorigene-sis[J].Nat Rev Cancer，2007，7（3）：165.

[17]Chu L L,Rutteman G R,Kong J M,etal.Genomic organization of the canine p53 gene and its mutational status in canine mammary neoplasia.Breast Cancer Res Treat,1998,50(1):11-25.

[18]Vousden K H，Lane D P.p53 in health and disease［J］.Nat RevMol Cell Bicol，2007，（8）:275-283.

[19]Helal E，Khalifa A，Kamel A S.Immunohisto-chemical expression of p53 and cerbB2 protein in breast cancer in Egypt［J］.Anticancer Res，2000，20(3B):2145-2150.

[20]王坤，周清，郑登云，等.P53、bcl-2和CD44v6蛋白表达与乳腺癌转移的相关性研究［J］.肿瘤防治研究，2005，32(12):748-751.

[21]王彤光，等.检测p53基因诊断犬乳腺恶性肿瘤的初步研究［J］.畜牧与兽医，2012，（04）：0077-03.

[22]Romero Q,Bendahl PO,Klintman M,et al.Ki67 proliferation in core biopsies versus surgical samplesa model for neo-adjuvant breast cancer studies[J].BMC Cancer,2011,（11）:341.

[23]Yerushalmi R,Woods R,Ravdin PM,et al.Ki67 in breast cancer:prognostic and predictive potential[J]. Lancet Oncol,2010,11(2):174-183.

[24]Aleskandarany MA,Rakha EA,Macmillan RD,et al.MIB1/Ki-67 labelling index can classify grade 2 breast cancer into two clinically distinct subgroups[J].Breast Cancer Res Treat,2011,127(3):591-599.

[25]Viale G,Giobbie-Hurder A,Regan MM,et al.Prognostic and predictive value of centrally reviewed Ki-67 labeling index inpostmenopausal women with endocrine-responsive breast cancer:results from Breast International Group Trial 1-98 comparing adjuvanttamoxifen with letrozole[J].J Clin Oncol,2008, 26(34):556 9-5575.

[26]Penault-Llorca F,Abrial C,Raoelfils I,et al.Changes and predictive and prognostic value of the mitotic index,Ki-67,cyclin D1,and cyclo-oxygenase-2 in 710 operable breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy[J].Oncologist,2008,13(12):1235-1245.

[27]Kashiwagi S,Yashiro M,Takashima T,et al.Advantages of adjuvant chemotherapy for patients with triple-negative breast cancer at Stage II:usefulness of prognostic markers E-cadherin and Ki67[J]. Breast Cancer Res,2011,13(6):R122.

[28]Fasching PA,Heusinger K,Haeberle L,et al.Ki67,chemotherapy response,and prognosis in breast cancer patients receiving neoadjuvanttreatment[J].BMC Cancer,2011,（11）:486.

[29]Von Minckwitz G,Schmitt WD,Loibl S,et al.Ki67 measured after neoadjuvant chemotherapy for primary breast cancer[J].Clin Cancer Res,2013,19(16):4521-4531.

[30]GERDES J，LEMKE H，BAISCH H，et al.Cell cycle analysis ofa cell proliferation associated human nuclear antigen defined by the monoelonal antibody Ki67［J］.J Immunol，1984，133(13):1710-1715.

[31]陈燕昌，林舜国，郑宇辉，等.乳腺癌Ki67抗原和DNA倍体的相关性及临床意义［J］.福建医科大学学报，2005，39(1):48-50.

[32]Santos,Andreia A.;Lopes,Celia C.;Ribeiro,Jorge R:Identification of prognostic factors in canine mammary malignant tumours:a multivariablen survival study[J].BMC Veterinary Research2013,（9）:1.

[33]Hayes DF,Sekine H,Ohno T,Abe M,Keefe K,Kufe DW:Use of a murine monoclonal antibody for detection of circulating plasma DF3 antigen levels in breast cancer patients[J].Clin Invest 1985,（75）: 1671-1678.

[34]Perey L,Hayes DF,Maimonis P,Abe M,O’Hara C,Kufe DW:Tumor selective reactivity of a monoclonal antibody prepared against a recombinant peptide derived from the DF3 human breast carcinomaassociated antigen[J].Cancer Res，1992,（52）:2563-2568.

[35]Schmidt-Rhode P,Schulz KD,Sturm G,Raab-frick A,Prinz H:CA15-3 in breast cancer:first experience with a new monoclonal test system.Med Sci Res 1987,（15）:7656.

[36]Crommelin DJA,Schellkens H:From clone to clinic.Dordrecht,The Netherlands:Kluwer Academic Publishers 11122:1990.

[37]Hollinghsworth MA,Swanson BJ:Mucins in cancer:protection and control of the cell surface[J].Nat Rev Canc，2004,（4）:45-60.

[38]Martin A,Corte MD,Alvarez AM,Rodriguez JC,AndicoecheaA,Bongera M,Junquera S,Pidal D,Allende T,Muiz JL,Vizoso F:Prognostic value of pre-operative CA 15.3 levels in breast cancer.Antican[J].Res 2006,26(5B):3965-3971.

[39]Agrawal AK,Jelen M,Rudnicki J,Grzebieniak Z,Zyko D,Kielan W,SolinaJ,Marek G:The importance of preoperative elevated serum levels of CEA and CA 15-3 in patients with breast cancer in predicting its histological type[J].Folia HistochemCytobiol 2010,48(1):26-29.

[40]Marchesi MC,Manuali E,Pacifico E,Ferri C,Romagnoli M,Mangili V,Fruganti G:Cancer antigen 15/3: possible diagnostic use in veterinary clinical oncology.Preliminary study[J].Vet Res Commun 2010, （34）(Suppl.1):103-106.

[41]Manuali et al.:CA 15-3 cell lines and tissue expression in canine mammary cancer and the correlation between serum levels and tumour histological grade[J].BMC Veterinary Research 2012，（8）:86.

[42]孙耘田.乳腺癌相关生物标志物[A].全国乳腺疾病病理学诊断及研究进展研讨会议论文集[C].2003.

[43]姚华，林德贵，张中文，等.E-cadherin在犬乳腺肿瘤中的表达[A].中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会[C].2010.

中图分类号：S858.292

文献标识码：A

文章编号：1003-6377（2015）06-0011-06

作者简介：马倩若（1989-），女（回族），硕士，研究方向为小动物临床外科学。E-mail：815093152@qq.com

通讯作者：林德贵（1961-），男，教授，博导，研究方向为小动物皮肤病，肿瘤病，真菌病和动物麻醉。E-mail:scamalin@sina.com

收稿日期：2015-09-12，修回日期：2015-09-17

Current Research on Markers Related to Canine Mammary Cancer

MA Qian-ruo，LIN De-gui*
(College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193，China)

Abstract：With the development of molecular biology,tumor marker detection is more and more widely used in the early diagnosis and treatment of canine mammary cancer.The paper briefly introduces current research on markers related to canine mammary cancer,which provides certain reference for the early diagnosis，predicting prognosis and guiding treatment.of canine mammary cancer.

Key words：canine mammary cancer;tumor;marker;early diagnosis