蛇床子素通过下调TGF-β1/Smad2信号通路抗野百合碱所致大鼠肺动脉高压



基础医学研究

蛇床子素通过下调TGF-β1/Smad2信号通路抗野百合碱所致大鼠肺动脉高压

李叶丽，王颖婉，钱志强，朱玲，杨丹莉

(遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察蛇床子素(Ost)对野百合碱所致大鼠肺动脉高压(PAH)的干预作用，并探讨其可能机制。方法 200~220 g清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组(n=8)，模型组(n=12)，Ost低、高剂量组(10、20 mg/kg，n=8)。所有大鼠适应性饲养1周后，模型组和Ost低、高剂量组大鼠经颈背部一次性皮下注射野百合碱 50 mg/kg建立PAH模型，Ost低、高剂量组于造模后第1天开始给药(ig，qd)，正常对照组和模型组给予等量溶媒。给药期间观察大鼠一般状况，给药28 d后采用右心导管术检测肺动脉压；通过HE染色观察肺小动脉病理学变化；Western blot检测肺组织转化生长因子(TGF)-β1蛋白的表达及Smad2的磷酸化水平。结果 与正常对照组相比，模型组大鼠肺动脉压升高(P<0.05)；肺小动脉中膜明显增厚、管腔狭窄；TGF-β1蛋白的表达及Smad2的磷酸化水平均明显上调(P<0.05)。与模型组相比，Ost低、高剂量组大鼠肺动脉压降低(P<0.05)；肺小动脉中膜变薄；TGF-β1蛋白的表达及Smad2的磷酸化水平均明显下调(P<0.05)。结论 Ost具有抗野百合碱所致大鼠PAH的作用，其机制可能与下调TGF-β1/Smad2信号通路有关。

[关键词]蛇床子素；野百合碱；SD大鼠；肺动脉高压；转化生长因子β1/Smad2

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺小动脉血管重构、肺血管阻力升高并进行性加重为主要特征，最终导致右心衰竭,甚至死亡的病理生理综合征[1]。该病发病隐匿、治疗棘手、预后恶劣。PAH的发生与肺动脉重构密切相关，肺动脉重构是内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞的增殖与凋亡速率失衡所致，主要表现为肺动脉内皮功能障碍，中膜平滑肌细胞异常增殖、并向内膜迁移，血管外膜胶原沉积，顺应性降低等[1-2]。研究表明，在野百合碱诱导的PAH中，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1蛋白的表达及Smad2的磷酸化水平均明显上调，从而促进了肺动脉重构和肺血管阻力的增加，最终加速PAH的发生与发展[3-4]。因此，抑制TGF-β1/Smad2信号通路的活化是防治肺动脉重构、治疗PAH的关键。

蛇床子素(Osthole，Ost)又名甲氧基欧芩酚、欧芹酚甲醚、喔斯脑，是从伞形科蛇床属植物蛇床Cnidiummonnier(L.) Cusson的果实中提取的一种香豆素类化合物，其化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高的一种烃基香豆素类有效化学成分[5]。已有研究表明，Ost具有抗炎、抗氧化、抗增殖、扩张血管、抑制血栓形成、抗血小板聚集、调血脂等药理作用，可用于高血压、心绞痛、冠心病、脑动脉硬化等疾病的治疗[6-8]。野百合碱诱导的PAH模型是目前公认较为理想的PAH模型之一，其不仅适用于阐明PAH的发病机制，还可用于新的治疗药物的测试[9]。因此，本研究拟采用野百合碱诱导的PAH模型，观察Ost对野百合碱诱导的PAH的作用，并探讨其相关机制，为Ost的开发利用提供基础药理学依据。

1材料与方法

1.1药品及试剂Ost(纯度≥98%，南京泽朗医药科技有限公司)；野百合碱(Sigma公司)；TGF-β1兔抗大鼠抗体(美国Abcam公司)；p-Smad2兔抗大鼠抗体(美国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的β-actin小鼠抗大鼠抗体(上海康成生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(英国CST公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；ECL+发光剂(江苏碧云天生物技术研究所)。

1.2实验动物200~220 g清洁级雄性SD大鼠，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2012-0005。

1.3主要仪器和设备PowerLab/8SP生物监测仪(澳大利亚AD instruments公司)；Leica光学显微镜及照相系统(德国Leica Microsystems Ltd)；Mini-PROTEAN3电泳仪、Mini Trans-Blot转移系统、CCD成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.4分组、造模及给药所有大鼠适应性饲养1周后，随机抽取8只经颈背部一次性皮下注射生理盐水5 mL/kg作为正常对照组，其余大鼠均经颈背部一次性皮下注射野百合碱 50 mg/kg建立PAH模型，造模大鼠随机分为3组。其中，Ost低、高剂量组于造模后第1天开始给药(ig，qd)，模型组和正常对照组给予等量溶媒(ig，qd)，分组情况如下:正常对照组(n=8)，模型组(n=12)，Ost低、高剂量组(10、20 mg/kg，n=8)。

1.5血流动力学检测给药28 d后，称大鼠体重，予7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉成功后，采用右心导管术从大鼠右侧锁骨下外静脉插入导管，经右上腔静脉进入右心房，再到右心室，最后转入肺动脉，根据压力波形变化判断导管是否进入相应部位，并采集肺动脉压力波形。

1.6肺小动脉病理学检查取左肺远离肺门处5 mm左右组织块，置于4%甲醛溶液中固定48 h后，脱水、包埋、行HE染色，光镜下观察肺小动脉病理学变化。

1.7肺组织TGF-β1蛋白和Smad2磷酸化水平的检测取各组大鼠冰冻肺组织约100 mg，剪碎后置于含有蛋白酶抑制剂和原钒酸钠的蛋白裂解液中，冰上匀浆提取总蛋白，BCA法对蛋白进行定量。10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后，TGF-β1、p-Smad2和β-actin蛋白分别采用恒流220 mA 湿转88、120和86 min至PVDF膜上，室温封闭2 h(封闭液为含有5%脱脂奶粉的TBST)，分别放入相应的一抗稀释液中4 ℃过夜(TGF-β1按1∶400稀释，p-Smad2按1∶500稀释，β-actin按1∶5 000稀释)，室温孵育二抗(1∶2 000)1 h，暗室曝光，采用Quantity One定量分析软件进行灰度分析。

2结果

2.1Ost对大鼠一般状况的影响与正常对照组相比，模型组大鼠在造模7 d后，毛发晦暗、呼吸急促、活动减少、进食减少，并分别于造模后第14、20、24、27天各自发性死亡1只。与模型组比较，Ost低、高剂量组大鼠毛发较为光泽、呼吸较为平稳、活动增加、食欲增强，且无死亡。

2.2Ost对大鼠肺动脉压的影响与正常对照组

相比，模型组大鼠肺动脉最大压明显升高(P<0.05)。与模型组相比，Ost低、高剂量组大鼠肺动脉最大压均降低(P<0.05)。结果(见图1)。

与正常对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。图1　Ost对大鼠肺动脉最大压的影响(n=6)

A：正常对照组；B：模型组；C：Ost低剂量组；D：Ost高剂量组。图2　Ost对大鼠肺小动脉形态学的影响(HE×200)

2.3Ost对大鼠肺小动脉形态学的影响与正常对照组相比，模型组大鼠肺小动脉中膜明显增厚、管腔狭窄。与模型组相比，Ost低、高剂量组大鼠肺小动脉中膜变薄、管腔增宽(见图2)。2.4Ost对大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达及Smad2磷酸化水平的影响与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织TGF-β1蛋白的表达和Smad2的磷酸化水平明显上调(P<0.05)。与模型组相比，Ost低、高剂量组大鼠肺组织TGF-β1蛋白的表达及Smad2的磷酸化水平均明显下调(P<0.05)。结果(见图3)。

与正常对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。　　图3　Ost对大鼠肺组织TGF-β1和p-Smad2的影响(n=3)

3讨论

野百合碱诱导的PAH是目前学术界公认的制备PAH的模型，野百合碱经肝代谢后生成野百合碱吡咯，后者选择性作用于肺血管床，使肺动脉内皮细胞受损，进而引起肺动脉高压。该模型具有操作简单、模型稳定等优点。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠肺动脉压升高，肺小动脉中膜明显增厚、管腔狭窄，表明造模成功。与模型组相比，Ost低、高剂量组肺动脉压降低，肺小动脉中膜变薄，提示Ost可能具有抗野百合碱所致大鼠PAH的作用。

TGF-β具有调控组织修复、刺激结缔组织生长、促使某些细胞因子生成，以及抑制血管形成等重要作用。在哺乳动物中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种亚型，其中以TGF-β1活性最强，在体细胞系中所占比例最高，也是TGF-β中研究最多的一个亚型。TGF-β1最初以无活性的前体蛋白存在，当受到炎性因子TNF-α及其他因素刺激后在体内酶解为活化型TGF-β1，并以自分泌和旁分泌的方式发挥调控作用。已有研究表明，TGF-β1是调控细胞增殖与分化的重要因子，能促进血管平滑肌细胞、成纤维细胞等增殖及表型转化，参与多种心血管疾病的发生[3]。

Smad家族是最早被证实的TGF-β1下游因子，TGF-β1/Smad2信号通路在肺动脉重构的发生与发展中扮演着重要角色。在静息状态下Smad2以单体形式存在，当TGF-β1与其受体结合后，会使聚集在受体复合物周围的Smad2，发生磷酸化并转移至胞核[10]。TGF-β1通过Smad蛋白信号转导刺激血管平滑肌细胞的增殖、迁移及纤连蛋白的合成，导致细胞外基质沉积、血管增生，加重肺动脉重构的发生[11-12]。

已有研究表明，在野百合碱诱导的PAH中，TGF-β1蛋白的表达及Smad2的磷酸化水平均明显上调，从而促进了肺动脉重构和肺血管阻力的增加，最终导致PAH的形成[3-4,13]。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白的表达和Smad2的磷酸化水平均明显上调，说明在野百合碱诱导的PAH模型中TGF-β1/Smad2信号通路被激活。与模型组相比，Ost低、高剂量组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白的表达和Smad2的磷酸化水平均下调，提示Ost可能通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路发挥抗肺动脉高压的作用。

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[收稿2015-09-25;修回2015-11-05]

(编辑：王静)

基础医学研究

Osthole reverses the pulmonary arterial hypertension in monocrotaline-treated rats through decreasing the TGF-β1/Smad2 pathways

LiYeli,WangYingwan,QianZhiqiang,ZhuLing,YangDanli

(Department of Pharmacology, Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of Osthole (Ost) on pulmonary arterial hypertension (PAH) in monocrotaline-treated rats, and to explore the mechanisms.Methods 200~220 g male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (n=8), model group (n=12), low dose of Ost treatment group (10 mg/kg, n=8) and high dose of Ost treatment group (20 mg/kg, n=8). All rats were given a single dose of monocrotaline 50 mg/kg subcutaneously to establish the PAH model except normal control group. Then the rats in the Ost treatment group were gavaged once daily from 1 day to 28 days. The other rats in the model group and normal control group were given the same amount of menstruum. After 28 days of administration, the pulmonary arterial pressure was measured by right heart catheterization. The morphological changes of the pulmonary artery were observed by HE staining. The protein expression of transforming growth factor (TGF)-β1 and the phosphorylation levels of Smad2 were detected by western blot.Results Compared with the control group, the pulmonary arterial pressure was increased (P<0.05), and the thickening of pulmonary artery was observed significantly in model group. The protein expression of TGF-β1 and the phosphorylation levels of Smad2 were up-regulated obviously in model group (P<0.05). Compared with the model group, the pulmonary arterial pressure was decreased (P<0.05), and the thickening of pulmonary artery was improved in Ost treatment group. The protein expression of TGF-β1 and the phosphorylation levels of Smad2 were down-regulated in Ost treatment group (P<0.05).Conclusion Ost can resist PAH in monocrotaline-treated rats, and the mechanism may be associated with decrease the levels of TGF-β1/Smad2 pathways.

[Key words]Osthole; monocrotaline; SD rats; pulmonary arterial hypertension; TGF-β1/Smad2

[中图法分类号]R961

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0567-04

[通信作者]杨丹莉，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理、抗炎免疫药理，E-mail:zmuyangdanli@foxmail.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81360498)；贵州省教育厅基金资助项目(NO：黔省专合字[201293)。