三种异喹啉型生物碱的微生物转化筛选



基础医学研究

三种异喹啉型生物碱的微生物转化筛选

付少彬1，龙书安1，张芸1，李义1，张茂生1，孟庆峰2

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义563099；2. 遵义医学院 公共卫生学院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 异喹啉型生物碱是生物碱的重要组成部分，药用价值高，本文拟筛选对3种四氢异喹啉型生物碱Z1(巴马亭)、Z2(番荔枝宁)、Z3(瑞枯灵)具有催化活性的微生物菌株,为后期通过微生物催化方法进行3种生物碱的结构修饰提供依据。方法 以微生物菌株为酶催化剂，将作为底物的3种异喹啉型生物碱与18种微生物菌株共培养，3~5 d后乙酸乙酯萃取发酵液，通过薄层色谱法(TLC)对转化反应进行筛选；Z1和Z2两种底物转化能力均较强的菌株03-L-93-Ⅱ通过ITS区序列进行种属鉴定。结果 经筛选的8株真菌、10株细菌中，03-L-93-Ⅱ、T002、T009、T016、T017具有转化Z1(巴马亭)的能力，T002、T009、T017、03-L-93-Ⅱ具有转化Z2(番荔枝宁)的能力，菌株L125-4对Z3(瑞枯灵)表现出微弱的转化活性。对菌株03-L-93-Ⅱ经分子生物学方法鉴定为Xylariales. Sp。结论 微生物菌株作为催化剂对四氢异喹啉型生物碱进行结构改造是可行的。

[关键词]生物转化；异喹啉型生物碱；菌株筛选；薄层色谱法(TLC)

生物碱是一类十分重要的天然产物，也是一类研究最早的有生物活性的天然化合物。生物碱类化合物大多具有很好的生理活性，常常作为许多中草药及药用植物的有效成分。四氢异喹啉类生物碱是生物碱类成分的重要骨架类型，具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗肿瘤、镇痛、抗心律失常、抗血小板聚集、降压、调节免疫等功能[1]，某些四氢异喹啉类生物碱如盐酸小檗碱、延胡索乙素等已经在临床上得到广泛应用。随着人们对四氢异喹啉类生物碱研究的不断深入，此类生物碱生物活性和结构改造也受到人们广泛关注[2]。

巴马亭(palmatine)，具有广谱抗菌作用，临床上可用于治疗妇科炎症、菌痢、肠炎、呼吸道和泌尿道感染、外科感染及结膜炎等[3]，此外还对蛙心有轻度兴奋作用、降压作用的报道[4-6]。番荔枝宁(xylopinine)，文献报道具有镇静、降压作用以及很强的抗疟活性[7-8]，并且还是合成其他异喹啉类生物碱的重要前体化合物。瑞枯灵(reticuline)，研究发现其具有较强的抗血小板聚集作用，可以抑制子宫平滑肌的收缩，具有中枢神经系统抑制等作用[9-11]。

四氢异喹啉类生物碱因其独特的化学结构和良好的生物、药理活性，长期以来备受化学家和生物学家的广泛关注。采用经典的化学合成方法进行结构改造已有报道[12-13]，但作为近年备受青睐的绿色化学方法-生物转化法却报道较少。本文通过细菌、真菌来筛选具有对3种异喹啉型生物碱巴马亭、番荔枝宁、瑞枯灵有转化活性的微生物菌株，为后续的结构改造以及为新药研发提供更具价值的先导化合物奠定基础。

1材料与方法

1.1材料底物Z1(巴马亭)、Z2(番荔枝宁)、Z3(瑞枯灵)均由本校药物化学教研室提供。供试微生物菌株共18种(包括常温菌和低温菌)，其中真菌L125-2、M2967-9、L77-1、01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ是由本研究人员从植物和地衣中分离的内生真菌，真菌CGMCC 3.2500、CGMCC 3.3657购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；土壤微生物T002、T003、T007、T008、T009、T0012、T013、T016、T017、T022由遵义医学院校园土壤分离得到。

1.2方法

1.2.1培养基的制作真菌培养基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L，将土豆削皮切成小丁，加水煮沸20~30 min，用8层纱布过滤，蒸馏水定容至1 L，滤液加葡萄糖，100 mL锥形瓶内装40 mL PDA液体培养基，固体培养基在上述成分里加20 g琼脂，121 ℃高压灭菌25 min即得。

细菌培养基的制作：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、蒸馏水1 L，分装于试管，每支5 mL液体LB培养基，固体培养基在上述成分里加20 g琼脂，121 ℃高压灭菌25 min即得。

1.2.2真菌对Z1、Z2、Z3转化反应的筛选将活化的8株真菌菌株L125-2、M2967-9、L77-1、01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、CGMCC 3.2500、CGMCC 3.3657于超净工作台中分别接入已灭菌的液体培养基中，每株菌接3瓶，共24瓶，放入恒温振荡器中震荡培养，其中菌株01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、3.2500、3.3657培养的最佳温度是28 ℃，菌株L125-2、M2967-9、L77-1最佳温度是16 ℃，转速160 rpm，3~4 d后每株菌的3个培养瓶中分别加底物Z1、Z2、Z3(用适量无水乙醇溶解，每瓶约5 mg底物)，放入恒温震荡培养箱与菌株共培养，5 d后用等体积乙酸乙酯萃取发酵液，60 ℃减压浓缩至小体积，分别以Z1、Z2、Z3为对照，通过TLC方法，以二氯甲烷∶甲醇=11∶1为展开系统，改良碘化铋钾显色检测转化反应。

1.2.3细菌对Z1、Z2、Z3转化反应的筛选取编号为T002、T003、T007、T008、T009、T0012、T013、T016、T017、T022土壤微生物分别于超净工作台中接于LB液体培养基，每株菌分别接3支试管，放入恒温震荡培养箱37 ℃震荡，转速160 rpm，12 h后加入底物Z1、Z2、Z3(用适量无水乙醇溶解，每支试管约0.5 mg底物)，底物与菌株共培养3 d后等体积用乙酸乙酯萃取，60 ℃减压浓缩至小体积，转化反应的检测方法同1.2.2。

1.2.4活性菌株转化反应的03-L-93-Ⅱ对两种底物Z1和Z2均表现出较好的转化活性的真菌菌株03-L-93-Ⅱ通过分子生物学手段对其ITS区 rDNA序列(ITS1+5.8S+ITS2)进行测序，并与GenBank数据库中序列进行Blast比对分析，鉴定到种属类群。

2结果

2.1真菌检测结果图1是真菌01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、CGMCC 3.2500对Z1、Z2、Z3的转化反应筛选结果，由图可见03-L-93-Ⅱ底物的显色斑点很小，而产物的显色斑点很大，提示其对Z1和Z2的转化效果较好。4株菌株对Z3的转化效果均不好，未发现明显的转化产物。图2A是TLC方法检测真菌对Z1的转化反应，菌株分别为L125-4、3.3657、L77-1、M2967-9，所有菌株均对Z1有转化反应，因为产物的显色斑点较小，而底物的显色斑点较大，提示其转化率不高。图2B表示TLC方法检测真菌对Z2的转化反应，菌株分别为L77-1、L125-4、3.3657、M2967-9，可能由于底物Z2在空气中长久放置或者底物污染，导致底物不纯，但不难看出L77-1、3.3657、M2967-9对底物有很弱的转化活性。图2C表示TLC方法检测真菌对Z3的转化反应，菌株分别为L77-1、L125-4、3.3657、M2967-9，结果显示所有菌株中L125-4对Z3有轻微的转化反应。

2.2细菌检测结果由图3A可见，细菌T002、T003、T007、T008、T009、T0012、T013、T016、T017、T022均对Z1有转化反应，其中T002、T009、T016、T017四株菌的转化效果较好，产物的显色斑点比底物的显色斑点较大。结果显示所有菌株均对Z2有转化反应，其中T002、T009、T016、T017四株菌的转化效果较好，产物显色斑点比底物显色斑点大(见图3B)。结果显示细菌中的所有菌株对Z3没有转化反应(见图3C)。

Z1、Z2、Z3分别代表3种底物，01、02、03、3.2分别代表真菌01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ和CGMCC 3.2500。　　图1　真菌01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、CGMCC 3.2500对Z1、Z2、Z3的转化反应筛选结果

Z1、Z2、Z3分别代表3种底物，L77、L12、3.3、M2分别代表真菌L77-1、L25-4、3.3657、M2967-9。　　图2　真菌L77-1、L125-4、3.3657、M2967-9对Z1(A)、Z2(B)、Z3(C)的转化反应

Z1、Z2、Z3分别代表3种底物，02、03、07、08、09、12、13、16、17、22分别代表细菌T002、T003、T007、T008、T009、T012、T013、T016、T017、T022。图3　TLC方法检测细菌对Z1(A)、Z2(B)、Z3(C)的转化反应

2.3活性菌株03-L-93-Ⅱ的鉴定对Z1和Z2两种底物均表现出较强的转化活性的真菌菌株03-L-93-Ⅱ经ITS区序列的测序分析，全长531 bp(见图4)，并与NCBI的Blast在线比对，与Xylariales.sp 相似度为99%，所以03-L-93-Ⅱ初步鉴定为Xylariales.sp。

图4　菌株03-L-93-Ⅱ的ITS区的基因序列

3讨论

四氢异喹啉型生物碱是存在于自然界中的重要生物碱，大多数表现出显著的生物活性，广泛存在于草药及药用植物中，往往是中草药的有效成分之一，故对此类结构生物碱为母核进行结构改造显得尤为重要。经典的化学合成方法可以实现四氢异喹啉型生物碱的结构改造，但是步骤相对繁琐，反应条件要求也比较高，而微生物转化反应条件温和、环境友好、选择性强[14-16]，也被誉为“绿色化学”，近年来成为化学合成领域的一大研究热点领域。而对于具有显著生物活性的四氢异喹啉型生物碱Z1(巴马亭)、Z2(番荔枝宁)、Z3(瑞枯灵)的微生物改造却少见报道，所以本文尝试微生物作为催化剂筛选对Z1(巴马亭)、Z2(番荔枝宁)、Z3(瑞枯灵)具有转化活性的菌株，为后期的结构修饰奠定基础。自然界存在大量的微生物，主要是细菌、真菌、放线菌3大类，本实验选用了土壤微生物(形态上多数为细菌)和真菌作为筛选的催化剂，真菌中包括常温真菌和极地低温真菌。从筛选结果看，能够催化Z1和Z2菌株数目较多，而菌株03-L-93-Ⅱ对Z1和Z2的转化效果较好。筛选的菌株中只有L125-4对Z3表现微弱的转化活性。下一步我们将对催化活性较强的菌株进行适当放大，并对其转化产物进行结构鉴定，为增加四氢异喹啉型生物碱的结构多样性及新药研发奠定基础。

[参考文献]

[1] Tang M C, Tang G L. Biosynthetic Progress of the Tetrahydroisoquinoline Antitumor Antibiotics[J]. Chin J Org Chem, 2012, 32(9): 1568-1576.

[2] Liu C J, Liu D Y, Xiang L.Bioactivity diversity and functional mechanism of etrahydroisoquinoline alkaloids[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2010, 45(1): 9-16.

[3] Chen T J, Xia W P, Zhou J Y, et al. Synthesis of Palmatine[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2010, 41(7): 494-495.

[4] Chen M Q, Qi Z Y. Comparison of some pharmacological activities palmatine and tetrahydropalmatine[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 1965, 12(3): 185-191.

[5] Hsieh M T, Su S H, Tsai H Y, et al. Effects of palmatine on motor activity and the concentration of central monoamines and its metabolites in rats[J]. Japanese Journal of Pharmacology, 1993, 61(1): 1-5.

[6] Xing S H, Zheng J L, Bian C F, et al. Effect of L-tetrahydropalmatine on desceasingblood pressure andimproving coronary artery circulation[J].Chinese journal of modern applied pharmacy, 1999, (16)4: 8-10.

[7] Naskanishi H. Pharmacological studies of xylopinine,2,3,10,11-tetramethoxy -5,6-13,13a-tetrahydro-8-dibenzo(a-g) quinolizine, semisynthesized from phellodend -rine isolated from phellodendronamurense rupr[J]. Jap J Pharmaco, 1962, 12(2): 208-222.

[8] Chea A, Hout S, Tabatabze N, et al. Antimalarial activity of alkaoids isolated from Stephania rotunda[J]. J Ethnopharmaco, 2007, 112(1): 132-137.

[9] Chen J J, Chang Y L, Teng C M, et al. Anti-platelet aggregation alkaloids and lignans from hernandia nymphaeifolia[J]. Planta Med, 2000, 66(3): 251-256.

[10] Morais L L, Barbosa-Filho J M, Almeida R N. Central depressant effects of reticuline extracted from Ocotea duckei in rats and mice[J]. J Ethnopharmacol, 1998, 62(1): 57-61.

[11] Martin M L, Teresa M, Montero M J, et al. Antispasmodic activity of benzylisoquinoline alkaloids analogous to papaverine[J]. Planta Med, 1993, 59(1): 63-67.

[12] Chen R J. Progress in total syntheses of jorumycin[J]. Journal of Jining Medical University, 2014, 37(1): 2-4.

[13] Zeng Q D, Zhang W P, Cheng P, et al. Study on synthesis of tetrahydroisoquinolines and monoamine oxidase inhibitory activity[J]. Journal of Chongqing Medical University, 2013(6): 574-576.

[14] 陈永正, 杨敏, 卓俊睿, 等. 微生物酶催化碳氢键的不对称氧化反应合成手性[J]. 遵义医学院学报, 2014, 37(1): 67-71.

[15] Fu S B, Yang J S, Cui J L, et al. Multihydroxylation of ursolic acid byPestalotiopsismicrosporaisolated from the medicinal plantHuperziaserrata[J]. Fitoterapia, 2011, 82(7): 1057-1061.

[16] 付少彬, 文福来, 闫松, 等. 微生物转化氧化槐定碱活性菌株的筛选[J]. 遵义医学院学报, 2015, 38(2): 190-192.

[收稿2015-10-11;修回2015-11-04]

(编辑：王静)

Strain screening on microbial transformation of three isoquinoline alkaloids

FuShaobin1,LongShu’an1,ZhangYun1,LiYi1,ZhangMaosheng1,MengQingfeng2

(1.School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective Isoquinoline alkaloids with high value in medicine were important structural type of alkaloids. The paper is to screen microbial strains which can catalyze isoquinoline alkaloids of palmatine (Z1), xylopinine (Z2), and reticuline (Z3).Methods Isoquinoline alkaloids as the substrates were co-cultured with microbial strains which were catalysts for five to seven days, then the conversion reactions were identified by thin layer chromatography; strain 03-L-93-Ⅱwith high catalytic activity to Z1 and Z2 was identified by sequence of ITS region.Results In 8 strains of fungi and 10 strains of bacteria, strain 03-L-93- II, T002, T009, T016, T017 showed transformation activity of substrate Z1, strain T002, T009, T017, 03-L-93-Ⅱ can transform Z2 to other compounds, while L125-4 showed weak catalytic ability of Z3. Strain 03-L-93-Ⅱwas confirmed asXylariales. Sp by molecular method.Conclusion The microbial strains as catalysts to modify the structure of tetrahydroisoquinoline alkaloids were feasible and identified.

[Key words]biotransformation; isoquinoline alkaloids; strains screening; thin layer chromatography

[中图法分类号]R932

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0591-04

[通信作者]付少彬，女，博士，副教授，研究方向：天然产物的生物催化研究，E-mail:fushb@126.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：21462057)；大学生创新创业项目(NO：201410661013，[2014]5838)；遵义医学院博士启动基金资助项目(NO：F-634)。