不同时程海洛因依赖大鼠胃窦CD4、CD8和IL-2表达*



不同时程海洛因依赖大鼠胃窦CD4、CD8和IL-2表达*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0959.017.html

夏白娟， 李一欣， 洪艳， 韩晶， 梁文妹

(贵阳医学院 组织学与胚胎学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨海洛因依赖期间大鼠胃窦内CD4、CD8及白细胞介素-2(IL-2)的表达。方法： 正常成年SD大鼠，随机分为正常对照组(NCG)、盐水对照组(SCG组)和不同时程海洛因依赖组(HDG组)；采用免疫组织化学SABC法及图像分析法，观察SCG组和HDG组造模第10、17、24、31及38天时大鼠胃窦黏膜CD4、CD8和IL-2表达。结果： 与NCG组及SCG组比较，HDG组大鼠胃窦CD4、IL-2 阳性细胞数量减少，染色变浅，图像分析的细胞计数和平均灰度值差异也有统计学意义(P<0.05)；HDG组大鼠胃窦CD8阳性细胞较NCG及SCG组细胞数量增多，染色变深，在海洛因依赖第24天变化最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。结论： 在海洛因依赖期间，CD4、IL-2 在胃窦表达减弱，CD8表达增强，提示海洛因依赖对大鼠胃黏膜免疫功能造成损伤。

[关键词]CD4阳性T淋巴细胞； CD8阳性T淋巴细胞； 白介素2； 胃窦； 海洛因； 大鼠，Sprague Dawley

阿片类物质滥用可对成瘾者消化系统造成明显的损害，引起胃肠蠕动减慢、消化道溃疡及胃肠功能紊乱等症状，可能与胃肠道的免疫功能降低有关[1-3]。T淋巴细胞在机体免疫中起着重要作用，主要包括CD4和CD8淋巴细胞两大亚群。分布在胃肠黏膜的CD4和CD8淋巴细胞能保护黏膜，防御病原菌的入侵。IL-2(interleukin-2)则是由CD4产生的一种细胞因子，能活化巨噬细胞，参与免疫防御。课题组前期研究曾报道过海洛因戒断、脱毒和复吸期间CD4、CD8和IL-2 在大鼠胃窦的表达变化，但目前对不同时程海洛因依赖大鼠胃黏膜免疫功能影响的研究少见报道，本实验通过建立相关大鼠模型，观察不同时程海洛因依赖期间(10、17、24、31、38 d)，CD4、CD8和IL-2在大鼠胃窦的表达，探讨海洛因依赖期间胃黏膜免疫功能的变化。

1材料与方法

1.1　动物分组与试剂

成年雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠66只，体质量180~220 g，由贵阳医学院实验动物中心提供；按配对原则随机分为正常对照组(normal control group，NCG)6只，盐水对照组(saline control group，SCG)和海洛因依赖组(heroin dependent group, HDG)，各30只。海洛因粉剂，纯度61.48%，由贵州省公安厅提供，临用时用灭菌注射用水溶解。

1.2　方法

1.2.1海洛因依赖大鼠模型 HDG组按体重逐日递增皮下注射海洛因药液，首日剂量为3 mg/kg，2次/日(上午8时，下午3时)，每日递增3 mg/kg，连续注射9 d至成瘾，第9天剂量为27 mg/kg。此后每日上午8时皮下注射海洛因一次，维持至取材，剂量为27 mg/kg。SCG组按体重每日注射HDG组相当剂量的生理盐水。NCG组不予任何处理。

1.2.2标本制备HDG组及SCG组分别于第10、17、24、31、38天取材，(分别为HDG10，HDG17，HDG24，HDG31，HDG38和SCG10，SCG17，SCG24，SCG31，SCG38组)每组每次处死6只，NCG组每次处死一只。取胃窦组织，多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，制成4 μm厚的连续切片。

1.2.3CD4、CD8和IL-2阳性细胞检测免疫组织化学SABC法，切片常规脱蜡脱水，室温10%甲醇-H2O210 min，正常羊血清(1∶50)室温下封闭20 min，分别滴加兔CD4、CD8和IL-2抗血清，4 ℃孵育过夜；羊抗兔 IgG(1∶100)37 ℃孵育20 min，SABC复合物(1∶100)37 ℃孵育20 min，DAB-H2O2液显色，苏木精复染细胞核，中性树胶封片。方法对照采用PBS缓冲液代替特异性抗血清，其余步骤同上。

1.2.4观察指标随机选取HDG组各时间点和同期SCG组各胃窦切片3例，NCG组3例于40倍物镜下，每例切片随机选取5个视野，大鼠胃窦黏膜中CD4阳性细胞经免疫组织化学染色之后可见免疫反应产物呈棕黄色，分布于黏膜内固有层，胞体小，多呈圆形、椭圆形；CD8阳性细胞经免疫组织化学染色之后可见免疫反应产物呈棕黄色或棕黑色，位于细胞胞膜和胞质内，多分布于胃窦黏膜固有层内；大鼠胃窦IL-2阳性细胞免疫反应产物呈棕黄色或棕黑色细颗粒状，存在于细胞胞质中，阳性细胞多分布于固有层腺底部的结缔组织中。用BioMias图像分析系统检测CD4、CD8和IL-2阳性细胞的平均灰度值。

1.3　统计学方法

2结果

2.1　一般情况

在实验过程中，SCG组和NCG组大鼠皮毛光滑，饮食正常，无拉稀便等现象，体重逐渐增长；HDG组大鼠随海洛因剂量的递增，从第10天开始出现典型的海洛因依赖症状。表现为：给药后动物呆滞、活动减少、嗜睡，四肢及躯体肌紧张，尾巴僵直上翘，两眼凸出、发亮，眼神迷离无光彩，用硬物戳之无反应，类似死后僵硬一般，这些表现持续约30 min；此后开始出现兴奋状态，表现为活动增多，乱窜，快速不停地转圈运动，舔毛，咬前爪及磕铁笼等,兴奋持续时间约90 min。

2.2　CD4、CD8和IL-2表达

光镜下， SCG各组和NCG组比较，大鼠胃窦中CD4阳性细胞的分布及免疫染色强度无明显差别(图1-A)；HDG组大鼠胃窦黏膜内的CD4阳性细胞数量随着海洛因依赖时间的延长逐渐减少，且免疫染色强度减弱(图1-B、图1-C)。SCG各组大鼠胃窦中CD8阳性细胞的分布及免疫染色强度与NCG组无明显差别，HDG大鼠胃窦黏膜内CD8阳性细胞在海洛因依赖早期没有太大变化，于依赖24 d时数量明显增加，免疫染色有所增强(图1-D、图1-E)。与NCG组比较，SCG组IL-2阳性细胞的分布及免疫反应染色强度均无明显变化，经统计学处理，该两组平均灰度值无显著差异(P>0.05)(图1-F)。海洛因依赖大鼠组胃窦IL-2阳性细胞数量减少(图1-G、图1-H)。

A~C为SCG10、HDG31及HDG38组 CD4阳性细胞，D~E为HDG24及HDG38组 CD8阳性细胞；F~H为SCG31、HDG17及HDG24 IL-2阳性细胞图1　各组大鼠胃窦CD4、CD8、IL-2免疫反应阳性细胞(SABC×400)Fig.1　The CD4, CD8 and IL-2 positive cells in gastric antrum of rats in each group

2.3　CD4、CD8和IL-2阳性细胞数量

大鼠胃窦黏膜CD4、CD8和IL-2阳性细胞数在NCG与SCG各组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。HDG组CD4和IL-2阳性细胞数量减少，与NCG、SCG比较差异有统计学意义(P<0.05)，且随着依赖时间的延长两种细胞减少的趋势越明显，差异有统计学意义(P<0.05)；HDG组CD8阳性细胞数量在海洛因依赖的第10、17天时无明显变化，在第24天时升高(P<0.05)，此后数量虽有所升高，但差异不具有统计学意义(P<0.05)，且CD4/CD8的比值明显<1。见表1。

表1　各组大鼠胃窦黏膜中CD4、CD8、IL-2阳性细胞数量

2.4　CD4、CD8和IL-2阳性细胞平均灰度值

CD4、IL-2阳性细胞的平均灰度值在NCG和SCG各组分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)； CD4阳性细胞和IL-2阳性细胞平均灰度值在HDG组随着海洛因依赖时间延长而逐渐增加，CD4差异有统计学意义(P<0.05)，而IL-2差异无统计学意义(P>0.05)。HDG组CD8阳性细胞平均灰度值在海洛因依赖第24天之后较NCG和SCG各组和HDG1、HDG2组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

(1)与本组内NCG、SCG各组比较P<0.05图2　各组大鼠胃窦黏膜中CD4、CD8、IL-2阳性细胞平均灰度值Fig.2　The average gray degree of CD4, CD8 and IL-2 positive cells in gastric antrum of rats in each group

3讨论

CD4淋巴细胞和CD8淋巴细胞参与了机体病毒免疫、抗肿瘤免疫等作用，在正常人体内的比例约为2[7-8]。CD4是辅助性T细胞的表面标志，CD8是杀伤性T细胞的表面标志。在免疫应答过程中，CD8+T细胞发挥细胞毒作用，特异性直接杀伤靶细胞；CD4+T细胞具有协助体液免疫和细胞免疫的功能。两者既相互联系、相互促进，又相互制约。其中任何一方异常、免疫调节失衡，即可出现病理状态。

研究发现阿片类物质对机体免疫系统有抑制作用[10]。对海洛因依赖患者外周血的检测也发现，CD4淋巴细胞数较正常值降低，CD4/CD8的比值<1[11-12]。本实验结果CD4淋巴细胞数随着海洛因依赖天数的增加而逐渐减少，免疫染色变浅，表明海洛因能加速CD4淋巴细胞凋亡使细胞数量减少，与Yin等[13]报道相符。CD8淋巴细胞数及免疫染色强度在海洛因依赖初期变化不明显，从第24天起细胞数增多，免疫染色逐渐加深，推测可能与CD8 淋巴细胞具有抑制T 细胞活性，对免疫应答有负调节效应有关，CD4/CD8比值的降低也提示胃黏膜免疫防御功能下降[14]。本实验中，海洛因依赖大鼠胃窦IL-2细胞的细胞数减少，免疫反应强度减弱，与Li HY等[15]的报道相符，表明CD4淋巴细胞数量减少，产生细胞因子IL-2的能力减弱。而IL-2能促进淋巴细胞的增殖，IL-2分泌的减少，对CD4淋巴细胞的增殖造成了影响[16]。在海洛因依赖期间，胃窦黏膜免疫功能受到严重损伤，这也是海洛因滥用者容易受病毒、细菌感染而出现相关临床并发症的原因之一。

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(2015-01-07收稿，2015-02-23修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌

The Expression of CD4, CD8 and IL-2 in Gastric Antrum of

Heroin-dependent Rats in Different Periods

XIA Baijuan, LI Yixin, HONG Yan, HAN Jing, LIANG Wenmei

(DepartmentofHistologyandEmbryology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the expression of CD4, CD8 and interleukin-2 (IL-2) in gastric antrum of heroin-dependent rats. Methods: Adult SD rats were divided into normal control group (NCG)，saline control group (SCG) and heroin-dependent group (HDG). Immunohistochemical SABC method and imagine analysis technique were performed to detect the expression of CD4、CD8 and IL-2 in the 10th,17th,24th,31stday after establishing heroin-dependent model.Results: The number of CD4, IL-2 positive cells and intensity of immunohistochemical staining of CD4, IL-2 in HDG were decreased, compard with NCG and SCG. The results of imagine analysis showed that the difference of the number and the average gray degree of CD4, IL-2 were statistically significant(P<0.05).Compared with NCG and SCG, the intensity of immunohistochemical staining and the number of CD8 positive cells in gastric antrum in HDG increased, the most obvious change appeared at 24thday of heroin dependence. Conclusions: The expression of CD4, IL-2 in gastric antrum is distinctly reduced, that of CD8 enhance during heroin dependence, suggesting that the immune function of rat antrum is damaged by heroin.

[Key words]CD4 positive T Cells； CD8 positive T Cells； interleukin-2； gastric antrum； heroin; rats,Sprague-Dawley

[中图分类号]R329.44； R34-33

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0241-04

[基金项目]*贵州省卫生厅优秀青年基金(No：G2009-11)；贵州省科技厅基金[黔科合J字2010(2153)]