青蒿-鳖甲药对配伍对MRL/lpr狼疮小鼠IL-6、IFN-γ分泌及狼疮性肾炎病理改变的影响*

青蒿-鳖甲药对配伍对MRL/lpr狼疮小鼠IL-6、IFN-γ分泌及狼疮性肾炎病理改变的影响*

摘要：目的：观察青蒿-鳖甲药对对MRL/lpr狼疮模型小鼠相关免疫指标及狼疮性肾炎(lupus nephri-tis,LN)病理改变的影响，探索青蒿-鳖甲药对对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的治疗机理。方法：采用ELISA方法检测小鼠血清中的IL-6、IFN-γ含量，对肾脏组织进行HE常规染色及PAS、Masson特殊染色。结果：灌胃青篙-鳖甲药对水煎液后，低、高剂量组MRL/lpr小鼠血清中的IL-6水平显著低于正常对照组(P<0.05或P<0.01)；高剂量组血清中的IFN-γ水平与模型组相比，显著下降(P<0.05)；高剂量组肾脏组织HE、PAS、Masson染色病理改变差异显著。结论：青蒿-鳖甲药对能抑制MRL/lpr小鼠血清中IL-6的生成，减少小鼠血清中IFN-γ的分泌，能明显改善小鼠狼疮性肾炎的病理状态。

关键词：青蒿-鳖甲药对；MRL/lpr小鼠；IL-6，IFN-γ；系统性红斑狼疮；狼疮性肾炎

青蒿苦辛而寒，其气芳香，清中有透散之力，清热透络，引邪外出。归肝、胆经。功善清热凉血、解暑除蒸，性寒而不伤脾胃，阴中有阳，降中有散。主肝肾三焦血分之病，适宜于SLE之肾精亏虚基础上的热毒为病。青蒿对免疫系统有调节作用，青蒿素类药物在低浓度时能增强免疫应答，但在高浓度时表现出中等程度的免疫抑制作用，并观察到青蒿素对分裂旺盛细胞具有抑制作用，用以防治SLE之细胞及体液免疫异常以及治疗过程中易继发感染[1-3]。鳖甲咸寒，直入阴分，滋阴退热，入络搜邪。鳖甲提取物能延缓疲劳的发生，也能加速疲劳的消除；鳖多糖能明显提高小鼠耐缺氧能力和抗冷冻作用及抗疲劳作用，有助于提高机体的抗病抗感染能力；鳖甲超微细粉具有增加骨密度的功能，在提高股骨骨密度及股骨骨钙含量方面优于碳酸钙[4]。青蒿与鳖甲配伍，滋阴退热，内清外透，使阴分伏热有外达之机。具有透热不伤阴，滋阴不碍邪作用。目前，对于青蒿、鳖甲各自的药理研究及药物成分研究较多，配伍研究较少，而且针对复方中核心药对的系统性研究和对其作用规律的探究能够更科学地指导临床应用，基于此，我们设计此项实验，通过观察青蒿-鳖甲药对对MRL/lpr狼疮模型小鼠相关免疫指标及狼疮性肾炎病理改变的影响，为临床应用提供实验依据。

1材料

1.1动物C57BL/6小鼠12只，MRL/lpr狼疮鼠36只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002，试验用基础饲料由浙江中医大学动物实验中心提供。

1.2药品青蒿、鳖甲生药材由浙江中医药大学饮片厂提供。青蒿鳖甲配伍水煎液制备：取青蒿药材200g、鳖甲药材120g(青蒿-鳖甲配比5∶3)。将鳖甲打碎先煎，倒入砂锅，加适量冷水，加盖，先以武火，沸腾后文火煎0.5h；再加入青蒿，煎15min，倒出药汁放水瓶中，再采用蒸发浓缩的方法煎至含生药量0.5 g/mL浓度，-20 ℃保存备用。

1.3仪器HERAEUS台式冷冻高速离心机，SPX-150B-Z型生化培养箱，Motic BA210正置生物显微镜。

2方法

2.1实验处理2月龄雄性MRL/lpr小鼠36只及2月龄雄性C57BL/6小鼠12只，随机分为正常对照组(C57BL/6小鼠)、模型组及低、高剂量给药组。正常对照组及模型组每日灌胃生理盐水1次，0.5mL/只。低、高剂量组以相当于正常成人每日用量5、10倍剂量给药，分别为0.1，0.2mL/10g(水煎液)，每日1次。正常对照组、模型组及2个用药组连续饲养用药2个月。

2.2样品采集采血前小鼠禁食12 h，眼球取血，收集血液3000 r离心15 min，分离血清，-80 ℃保存备用；取适量肾脏组织，液氮保存，即刻存入。采血后将小鼠脱臼处死，迅速取出肾脏，固定于4%的甲醛溶液中。

2.3指标检测采用ELISA法测定各组小鼠血清IL-6、IFN-γ水平，检测步骤按说明书进行。

对肾脏石蜡切块进行常规HE染色和PAS、Masson特殊染色，观察不同组别肾脏的病理改变。

3结果

3.1青蒿鳖甲药对对MRL/lpr狼疮鼠血中IL-6、IFN-γ水平的影响见表1。与模型组比较，低剂量组、高剂量组血清中IL-6和IFN-γ的含量有显著性差异(P<0.05)。

表1青蒿鳖甲药对对MRL/lpr狼疮鼠血清

pg/mL

注：与正常对照组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与模型组比较，△P<0.05。

3.2青蒿鳖甲药对对MRL/lpr狼疮小鼠肾脏病理改变的影响青蒿鳖甲药对对MRL/lpr狼疮小鼠肾脏病理改变的影响以HE和PAS、Masson染色观察小鼠肾组织的改变，光镜下可见：正常对照组肾组织(见图1～3)；模型组：肾小球系膜细胞和内皮细胞弥漫性重度增生，白细胞浸润，系膜区及内皮下大量嗜复红蛋白沉积，节段性白金耳样结构形成，肾小管上皮细胞空泡及颗粒状变性(见图4～6)；低剂量给药组：基本同模型组(见图7～9)；高剂量给药组：肾小球系膜细胞轻度增生，少数白细胞浸润，伴少量嗜复红蛋白沉积，无白金耳样结构形成，未见肾小管上皮细胞空泡及颗粒状变性(见图10～12)。

4讨论

系统性红斑狼疮是一种原因不明的自身免疫性疾病，以淋巴细胞异常活化、免疫调节功能紊乱和多种自身抗体过量产生为特征。SLE病情复杂多变，涉及全身多个脏器，其中，狼疮性肾炎引起的肾功能衰竭是其主要死亡原因之一，而细胞因子网络的改变是影响免疫调节的重要因素，包括IL-6和IFN-γ等影响因子。IL-6是一种具有多功能的细胞因子，它的异常表达和失调是某些免疫疾病的典型特征。研究表明，IL-6与IL-6受体结合后促进B细胞活化，产生大量的自身抗体，导致SLE的免疫损伤，而且系统性红斑狼疮患者血清中存在IL-6的明显异常，与疾病活动性及肾损害有明显相关性[5]。IFN-γ可促发SLE并加重SLE病情，IFN-γ除可作为SLE患者的诊断指标外，还可以作为SLE患者病情活动程度和疗效观察的指标[6-7]。因此，MRL/lpr狼疮模型小鼠血清中IL-6、IFN-γ水平的检测，是判定青蒿-鳖甲药液对于狼疮鼠病理状态改善与否的比较准确的指标。

图1～12　各组小鼠肾组织病理检查

注：图1～3分别为正常MRL/lpr小鼠肾组织(图1 HE，光镜×400；图2 PAS，光镜×400；图3 Masson，光镜×400)；图4～6分别为模型组MRL/lpr小鼠肾组织的病理改变：肾小球系膜细胞和内皮细胞弥漫性重度增生，白细胞浸润(图4 HE，光镜×400)；肾小球基底膜增厚，系膜基质增多(图5 PAS，光镜×400)；系膜区及内皮下大量嗜复红蛋白沉积，节段性白金耳样结构形成，肾小管上皮细胞空泡及颗粒状变性(图6 Masson光镜×400)；图7～9为低剂量给药组MRL/lpr小鼠肾组织的病理改变，基本同模型组(图7 HE，光镜×400；图8 PAS，光镜×400；图9 Masson光镜×400)；图10～12为高剂量给药组MRL/lpr小鼠肾组织的病理改变：肾小球系膜细胞轻度增生，少数白细胞浸润(图10 HE，光镜×400)；肾小球基底膜轻度增厚，系膜基质轻度增多(图11 PAS，光镜×400)；有少量嗜复红蛋白沉积，无白金耳样结构形成，未见肾小管上皮细胞空泡及颗粒状变性(图12 Masson光镜×400)。

本研究以MRL/lpr小鼠血清中IL-6、IFN-γ水平变化作为药物疗效的指标，分别按照低、高两个剂量青蒿-鳖甲药液给MRL/lpr小鼠连续灌服2个月，观察不同剂量青蒿-鳖甲煎剂对狼疮性肾炎的影响，结果发现，其中高剂量给药组可明显减轻狼疮性肾炎的活动程度，改善狼疮性肾炎的病理状态。这与报道的青蒿素类能减低多种细胞因子，减少免疫损伤的结论一致[8]。同时，有实验证实，IFN-γ在自身免疫性疾病中是造成病理性损害的主要原因之一[9]，实验发现低、高两个剂量的青蒿-鳖甲药液均能抑制小鼠血清中炎性因子IL-6的分泌，可明显降低血清中IFN-γ的水平，从而减少了因自身免疫复合物的分泌而造成的病理性损害。青蒿-鳖甲药对，作为复方中的核心药对，弥补了单味药治疗疾病的不足，这为青蒿-鳖甲药对更广泛更科学的应用于临床提供了实验依据。

参考文献

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Effects of Qinghao-biejia Group on the Production of IL-6、IFN-γ and Pathologic Change of Lupus Nephritis in MRL/lpr Mice

GAN Jing, XIE Zhi-jun, SHAO Tie-juan, YAN Yu-ming, WEN Cheng-ping, CHEN Juan

ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053,China.

Abstract:Objective: To investigate the effect of Qinghao-biejia group on auto-antibody production and pathologic change of lupus nephritis in MRL/lpr mice and the possible mechanism of qinghao-biejia group in treating systemic lupus erythematosus(SLE).Methods: IL-6 and IFN-γ in serum of the MRL/lpr mice were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Renal tissue was stained by HE，PAS and Masson.Results: In the low and hight dose qinghao-biejia groups,as compared with the normal control group,the level of IL-6 was significantly lower(P<0.05,P<0.01);The level of IFN-γ was lower in the hight dose than in the model group(P<0.05);And renal pathological change was milder.Conclusion: qinghao-biejia group could inhibit the production of IL-6 and secretion of IFN-γ and improve the pathologic lesion of lupus nephritis in MRL/lpr mice.

Key words:Qinghao-biejia Group; MRL/lpr mice; IL-6; IFN-γ; Systemic Lupus Erythematosus; Lupus Nephritis

收稿日期：(2014-12-12)编辑：曾文雪

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

基金项目：*浙江省科技厅公益性应用研究计划项目(2013C37100)；国家自然科学 (81273680、81173249)；2012年博士点基金新教师类项目(20123322120001)。

通信作者：★甘静谢志军邵铁娟严余明温成平陈娟*陈娟。Tel：18157141586，E-mail：164245882@qq.com。(浙江中医药大学基础医学院杭州 310053)