低温和外源NO对铁皮石斛原球茎多糖合成的影响

张开会，高素萍，刘柿良，李巧自，张科燕

（1四川农业大学风景园林学院，成都611130；2四川农业大学园林研究所，成都611130）

低温和外源NO对铁皮石斛原球茎多糖合成的影响

张开会1，高素萍2＊，刘柿良1，李巧自1，张科燕1

（1四川农业大学风景园林学院，成都611130；2四川农业大学园林研究所，成都611130）

以铁皮石斛（Dendrobium officinale）原球茎为材料，研究了低温（4℃）、外源NO（NO供体SNP）以及NO清除剂（cPTIO）和一氧化氮合酶抑制剂（PBITU）对铁皮石斛原球茎中NO含量、蔗糖合成酶（SS）活性、多糖含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖等糖含量的影响，以明确低温和內源NO在多糖合成中的关系。结果显示：（1）4℃低温处理下，铁皮石斛原球茎中NO含量显著上升，SS活性升高，蔗糖、果糖和葡萄糖含量增加，多糖含量也得到提高；SNP（0.5mmol·L－1）处理与4℃低温处理具有相似的效果；且低温诱导的铁皮石斛原球茎中SS活性提高和多糖含量的增加时期均在NO大量产生之后、蔗糖的积累早于果糖和葡萄糖。（2）4℃低温＋SNP组合处理能够显著提高铁皮石斛原球茎中SS活性、NO含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖含量，它们分别比对照组显著高出了68.04%，96.20%，60.69%、45.64%、66.90%和67.03%，且比低温和SNP单独处理效果都好。（3）PBITU能够部分抑制低温诱发铁皮石斛原球茎中产生NO，抑制率达到77.15%；同时还抑制了低温对铁皮石斛原球茎中SS活性、多糖合成和蔗糖、果糖、葡萄糖积累的促进作用。（4）SNP＋cPTIO和4℃＋cPTIO处理组中铁皮石斛原球茎SS活性和蔗糖、果糖、葡萄糖、多糖含量及NO水平，且与对照组差异不显著。研究表明，低温和外源NO对铁皮石斛原球茎多糖的合成均具有促进作用，并且低温可诱导铁皮石斛原球茎产生NO，SS活性提高和多糖含量增加与NO产生相关，说明NO是诱导铁皮石斛原球茎多糖合成所必需的信号分子。

低温；一氧化氮；铁皮石斛原球茎；多糖；蔗糖合成酶

铁皮石斛（Dendrobium officinale）花型奇特，高雅芳香，是当今世界上流行的兰花之一，也是中国名贵的中草药［1］。铁皮石斛具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖和增强机体免疫力等药理作用［2－3］。由于铁皮石斛对生长环境要求苛刻，自然繁殖率低，且多年来对其过度采挖，造成野生铁皮石斛资源日趋减少［1］。而目前人工栽培技术不够完善，试管苗移植成功率不高，多方因素造成了药材供需紧张。多糖是铁皮石斛的主要活性成分，有文献报道铁皮石斛原球茎同原药材多糖含量非常接近［4－5］，且药理作用相同［6－7］。已有研究表明，影响铁皮石斛原球茎多糖含量的因素主要包括碳源、氮源的种类和浓度［8－9］，外源激素和有机物［10］，以及光照强度［11］等。苏江等［8］发现添加蔗糖有利于铁皮石斛原球茎中多糖的积累。孟衡玲等［12］和滕建北等［13］进一步证实，蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）活性、蔗糖含量与铁皮石斛多糖的合成积累密切相关。原球茎（protocorm）是离体培养产生的组织，具有增殖效率高、生长周期短、可实现规模化生产的特点，并具备与原植物同样的形态发育和物质代谢潜能［4］。铁皮石斛原球茎可能部分替代原植物成为药源，这将对铁皮石斛资源的保护、再生和合理利用具有重要意义。

目前，已有研究发现低温可诱发植物产生防御反应，有利于其次生代谢产物的合成。低温可促进金丝桃（Hypericum brasiliense）中桦木酸（betulinic acid）和酚类化合物（phenolic compounds）的合成积累［14］以及睡茄（Withania somnifera）中睡茄素A（withanolide A）的合成［15］。

NO（Nitric oxide）已被证实是植物中的一种新型信号分子。近年来有一些研究报道NO参与了生物胁迫和非生物胁迫诱导的药用植物次生代谢产物的合成调控［16］。Wang等［17］研究表明，真菌诱导子诱发了红豆杉悬浮细胞中NO的产生，同时促进了紫杉醇的生物合成，NO的合成主要是通过一氧化氮合酶（NOS）途径产生。Zhang等［18］的研究发现，紫外线（UV－B）处理下，垂枝桦（Betula pendula）叶片中硝酸还原酶（NR）活性升高，诱发了NO产生，并增强了NIA1和NIA2基因的表达和黄酮类（flavonoid）的合成。NO可能通过介导生物和非生物诱导子诱发植物细胞的防御反应，激活细胞中次生代谢产物的合成代谢途径。外源NO对植物次生代谢产物的合成也具有促进作用。添加NO供体硝普钠（SNP）有利于长春花（Catharanthus roseus）悬浮细胞中长春碱（catharanthine）的积累，并且具有剂量依赖性［19］。外源NO还可以通过提高半夏组培苗体内苯丙氨酸解氨酶（PAL）、谷氨酸合酶（GOGAT）、谷草转氨酶（GOT）活性加速无机氮的同化及转化效率，提供更多的代谢前体物质以促进总生物碱（total alkaloids）及鸟苷（guanosine）积累［20］。近年来的研究表明，NO、水杨酸（SA）、活性氧（ROS）等植物体内的主要信号分子（途径）不仅参与植物细胞次生代谢的信号调控，而且不同信号途径之间可以通过共催化、互抑制、共协调等作用相互交叉形成复杂的信号调控网络［21］。从而证实了NO在植物细胞次生代谢信号调控网络中的潜在分子开关作用。

由于铁皮石斛原球茎多糖合成途径尙不明确，对于NO和低温是否参与原球茎中多糖合成积累及其作用机制等问题有待研究证实。为此，本试验以外源NO和低温处理铁皮石斛原球茎，分别研究了两者对原球茎中多糖合成的影响以及低温与内源NO在多糖合成过程中的关系。为进一步探寻铁皮石斛原球茎多糖合成途径提供理论基础，同时也为利用原球茎直接生产多糖提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 铁皮石斛原球茎的培养

本试验所采用的材料是从云南西双版纳药用植物研究所引进的铁皮石斛无菌苗。选取长势健壮，株高在3cm以上的无菌苗作为试验对象。在超净工作台上小心剥去叶片、切除根部，将茎段切成0.5～1.0cm的带节小段，接种于诱导培养基上，其配方为：MS＋1.0mg·L－16－BA＋0.5mg·L－1NAA。30d后将诱导出的原球茎接种于增殖培养基（MS＋1.0mg·L－16－BA＋0.2mg·L－1NAA）中，继代培养60d后接种到MS固体培养基中培养，添加蔗糖30g·L－1、琼脂7g·L－1，pH值为5.8。试验所用的铁皮石斛原球茎已经过30～40次继代培养（每30d继代1次），具有稳定的形态特征和生长速率。试验所用培养基为MS固体培养基，添加物及pH值均同上。培养条件为：无菌培养室昼／夜温度为25℃／15℃，光照时间昼／夜为14 h／10h，光照强度2 000lx。

1.2 试验处理

1.2.1 低温处理 挑选长势均一、生长状态良好、色泽鲜绿无分化的铁皮石斛原球茎接入到组织培养瓶中，每瓶2.0g。试验设置4℃低温和对照（CK）2个处理，每个处理3次重复。对照处理放入无菌培养室，低温处理置于人工智能培养箱中，光照条件同无菌培养室，处理24h后放回无菌培养室进行恢复培养。分别于处理0h、4h、8h、12h、24h及恢复7 d、14d测定NO、多糖、蔗糖、果糖和葡萄糖等含量及蔗糖合成酶（SS）活性。

1.2.2 外源NO处理 添加NO供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）0.5mmol／L于组织培养瓶中，对照（CK）处理加入等体积灭菌后的蒸馏水。SNP溶液经0.22μm微孔滤膜进行过滤灭菌加入到灭菌后的培养基中。将铁皮石斛原球茎接入到上述处理的培养基中，然后放入无菌培养室培养。原球茎接种量、试验重复设置和指标测定时间同低温处理，测定的指标包括多糖、蔗糖、果糖和葡萄糖等含量及SS活性。

1.2.3 验证试验处理 以铁皮石斛原球茎进行SNP、NO清除剂cPTIO（2－4－carboxyphenyl－4，4，5， 5－tetramethylimidazoline－1－oxyl－3－oxide）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制剂PBITU（S，S′－1，3－phenylene－bis（1，2－ethanediyl）－bis－isothiourea）对NO释放、SS活性、多糖合成以及各种糖含量的影响试验。SNP、cPTIO及PBITU溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，按照试验要求向培养基中加入不同体积的上述溶液，对照组加入等体积灭菌后的蒸馏水。试验包括6个处理，即CK（蒸馏水）、4℃低温、0.5mmol·L－1SNP、4℃＋0.5 mmol·L－1SNP、4℃＋0.2mmol·L－1PBITU、4℃＋5mmol·L－1cPTIO、0.5mmol·L－1SNP＋5mmol·L－1cPTIO，每个处理3次重复。原球茎的接种量及接种方法同上。处理8h测定NO含量，24h测定蔗糖含量，R－7d（恢复7d）测定SS活性、多糖、果糖和葡萄糖等含量。试验中所用cPTIO和PBITU均购自美国Sigma－Aldrich公司。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 NO含量 参照李杰等［22］的方法提取铁皮石斛原球茎中NO，采用NO含量测定试剂盒（试剂盒购自南京建成生物工程研究所）说明书提供的方法测定NO含量，结果以μg·g－1表示。

1.3.2 多糖含量 先将各处理的原球茎洗净培养基，在烘箱中105℃杀青20min后以60℃烘48h至恒重。然后研磨过40目筛，称取干品粉末0.1g，参照叶余原等［23］的超声法提取多糖，稍加改进。多糖测定采用苯酚硫酸法［24］，测得标准曲线为：y＝142.94x＋1.166 6（R2＝0.996），以标准曲线计算多糖含量，单位为mg·g－1。

1.3.3 蔗糖合成酶活性 依据滕建北等［13］的方法，测定SS活性。称取0.5g原球茎鲜样，加入5 mL提取介质（100mmol·L－1pH 7.2Tris－HCl，10mmol·L－1MgCl2，1mmol·L－1EDTA－Na2，10mmol·L－1DTT，2%乙二醇）于研钵中磨成匀浆后，倒入离心管，在低温冷冻超速离心机上12 000 r／min离心10min，取上清液进行酶活性测定。酶活性用每小时每克鲜重的蔗糖微克数表示（μg· g－1·h－1）。

1.3.4 糖含量测定 （1）蔗糖和果糖含量：蔗糖和果糖含量的测定采用曾俨等［25］的方法，称取原球茎干品粉末约0.1g放入试管中，加入5mL蒸馏水于沸水中提取，取0.2mL提取液进行测定，测得蔗糖标准曲线为：y＝475.7x（R2＝0.996），果糖标准曲线为：y＝268.2x－2.372（R2＝0.996）。以标准曲线计算蔗糖和果糖含量，结果以mg·g－1表示。所得果糖含量为提取液中总果糖基含量，应减去蔗糖中所含果糖量（可由已测的蔗糖含量推导出来），即得到实际果糖含量。（2）葡萄糖含量：采用葡萄糖氧化酶法，根据葡萄糖测定试剂盒中的说明操作（试剂盒购自南京建成生物工程研究所），结果以mmol ·L－1表示。

1.4 数据分析处理

试验测得数据采用Microsoft Excel 2007进行相关分析并作图，运用SPSS 17.0统计软件进行方差分析（ANOVA），采用Duncan法进行差异显著性检验（α＝0.05）。

2 结果与分析

2.1 低温对铁皮石斛原球茎内源NO产生、SS活性和糖类合成积累的诱导

如图1所示，在低温刺激下铁皮石斛原球茎中NO含量先急剧上升，处理8h后达到最高，并显著高于对照水平（图1，A；P＜0.05），随后又迅速降低，但始终显著高于对照；同时，原球茎中SS活性在4℃低温处理8h后开始缓慢上升，并在恢复期持续升高，恢复14d的SS活性高出对照2倍多（图1，B）；同期原球茎中多糖含量在处理12h后才开始增加，并在恢复期间持续增加，恢复14d时的含量是对照的3倍（图1，C）。可以看出，低温诱导的铁皮石斛原球茎中SS活性提高和多糖含量的增加时期均在NO大量产生之后，NO产生与SS活性提高和多糖含量增加相关。

另外，由图2可知，铁皮石斛原球茎中蔗糖含量在4℃低温处理4h后缓慢增加，在处理24h后达到峰值，并显著高于对照（图2，A，P＜0.05）；而其果糖和葡萄糖含量在低温处理12h后才出现上升趋势，且在恢复期持续增长，于恢复14d后均高出对照2倍多（图2，B、C）。说明低温促进了铁皮石斛原球茎中蔗糖、果糖和葡萄糖等糖类物质的积累，并且蔗糖的积累早于果糖和葡萄糖。

2.2 外源NO对铁皮石斛原球茎中SS活性及糖类合成积累的诱导作用

如图3所示，以SNP单独处理铁皮石斛原球茎对其SS活性及多糖的含量都有促进作用。其中，在SNP单独处理下，铁皮石斛原球茎中的SS活性渐渐上升，并在恢复7d后达到峰值，且显著高于对照（图3，A；P＜0.05）；而其多糖含量的变化趋势与SS活性相似，也在恢复7d后达到最大值，此时高出对照3倍左右（图3，B）。

同时，以SNP单独处理铁皮石斛原球茎也有利于蔗糖、果糖和葡萄糖的积累（图4）。铁皮石斛原球茎中蔗糖含量在SNP单独处理4h后开始明显增加，在处理24h后达到峰值，此时约是对照的2倍，在恢复期则降低，但仍明显高于同期对照（图4，A）；而其果糖和葡萄糖含量在处理8h后才出现上升趋势，在恢复7d后达到峰值，并显著高于对照水平（图4，B、C；P＜0.05），而后降低。可见。外源NO处理同样有利于铁皮石斛原球茎中SS活性增强和多糖、蔗糖、果糖、葡萄糖的积累。

2.3 cPTIO和PBITU对低温和外源NO诱导的抑制作用

为了进一步证实外源NO和低温在诱导铁皮石斛原球茎多糖合成中的作用，以及低温和内源NO在多糖合成中的关系，分别考查了NO清除剂cPTIO和一氧化氮合酶抑制剂PBITU对低温和SNP处理下铁皮石斛原球茎中NO含量、SS活性、多糖含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖等糖含量的影响。如表1所示，4℃低温＋SNP组合处理能够显著提高铁皮石斛原球茎中SS活性、NO含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖含量，它们分别比对照组显著高出了68.04%，96.20%，60.69%、45.64%、66.90%和67.03%，且比低温和SNP单独处理效果都好。PBITU能够部分抑制低温诱发铁皮石斛原球茎中产生NO，抑制率达到77.15%；同时还抑制了低温对铁皮石斛原球茎中SS活性、多糖合成和蔗糖、果糖、葡萄糖积累的促进作用。SNP＋cPTIO和4℃＋cPTIO处理组中铁皮石斛原球茎SS活性和蔗糖、果糖、葡萄糖、多糖含量及NO水平与对照组差异不显著（P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 低温对铁皮石斛原球茎多糖合成的影响

本研究表明，低温（4℃）处理下，铁皮石斛原球茎中NO产生、SS活性升高、多糖合成加强以及蔗糖、果糖、葡萄糖增加，且这些反应具有先后顺序。在低温处理下，首先是NO含量急剧上升，然后蔗糖含量在低温处理4h后开始增加，随后SS活性在8 h后持续升高，而葡萄糖、果糖和多糖含量在12h后才开始缓慢增加。表明铁皮石斛原球茎中NO产生、SS激活、糖积累和多糖合成之间具有因果关系。铁皮石斛原球茎多糖主要由葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖等多种单糖组成［4］。蔗糖合成酶是调控蔗糖代谢的关键酶之一，目前普遍认为蔗糖合成酶的主要功能是在蔗糖的降解方向，为多糖的合成提供前体物质，催化蔗糖进入各种代谢途径［12］。低温首先刺激了NO产生，然后促进了蔗糖的积累，随后激活了SS，进一步促进了蔗糖分解成果糖和葡萄糖，为多糖合成提供了前体物质，最终导致多糖的合成。

在验证试验中表明，低温处理下刺激了铁皮石斛原球茎中产生NO，PBITU和cPTIO抑制了其产生，同时还抑制了低温对铁皮石斛原球茎中SS活性、多糖合成和蔗糖、果糖、葡萄糖的促进作用。说明低温诱导所产生的NO是其触发铁皮石斛类原球茎SS活性、糖积累和多糖合成所必需的信号分子。本研究与Zhang等［18］证实UV－B辐射引起NO含量升高，NO作为信号分子参与UV－B对植物细胞中黄酮类物质合成的信号转导过程等报道有相似之处。低温可作为一种外界信号刺激植物细胞，然后与胞内信使NO结合，从而引起细胞膜上和细胞内一系列反应，引发相关酶活性的变化及基因的表达，最终导致次生代谢产物的合成和积累［26］。

3.2 外源NO对铁皮石斛原球茎多糖合成的影响

在本次研究中还发现，外源NO（SNP）直接处理也能提高铁皮石斛原球茎中SS活性，增加蔗糖、果糖、葡萄糖等含量以及促进多糖的积累，而这些促进作用被cPTIO所阻断，表明这些作用确实是由SNP分解出的NO所产生的。并且外源NO触发的铁皮石斛原球茎中SS激活、糖积累和多糖合成的先后顺序与低温处理相同，表明外源NO所诱导的多糖合成途径与低温作用相似。王博等［27］研究表明，水杨酸（SA）作为信号分子能够促进蔗糖的吸收与分解，提高胞内果糖和葡萄糖的含量，改善霍山石斛（Dendrobium huoshanense）类原球茎对碳源的利用，从而促进多糖的合成。在铁皮石斛原球茎多糖合成过程中，NO作为信号分子发挥了和SA相似的作用。另外一项研究发现，SNP处理下使霍山杂交石斛类原球茎产生防御反应，发生活性氧迸发，从而促进了生物碱的积累［28］。因此，本试验中SNP对铁皮石斛原球茎多糖的促进作用可部分归因于SNP促发了铁皮石斛原球茎的防御反应，使得蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖积累，从而有利于多糖的合成。

低温和SNP组合处理能够显著提高铁皮石斛原球茎中NO含量，增强SS活性，增加蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖含量，比低温和SNP单独处理效果好。cPTIO能够有效清除NO，强烈地抑制了低温和SNP对SS活性、糖积累和多糖合成的促进作用。推测可能是低温诱导的内源NO和外源NO产生了协同作用，使铁皮石斛原球茎中NO总含量增加，从而使多糖合成加强，其作用效果强于低温和SNP单独处理。在用超声波诱导红豆杉（Taxus yunnanensis）细胞中NO产生和紫杉醇的生物合成的研究中也得到了类似的结果［29］，但其具体作用机制尚不明确，有待进一步探究。

综上所述，低温可作为一种外界信号刺激铁皮石斛原球茎产生胞内信使NO，并与之结合引发了SS活性升高，蔗糖、果糖和葡萄糖含量增加，为多糖合成提供前体物质，最终导致多糖的合成积累；外源NO一方面可作为信号分子提高SS活性，促进蔗糖的吸收与分解，提高铁皮石斛原球茎胞内果糖和葡萄糖的含量，改善铁皮石斛原球茎对碳源的利用，从而促进多糖的合成。另一方面还可通过促发铁皮石斛原球茎的防御反应，使得蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖积累，从而有利于多糖的合成。所以，低温和外源NO对铁皮石斛原球茎多糖的合成均有促进作用，并且低温可诱导铁皮石斛原球茎产生NO，NO是其诱导多糖合成所必需的信号分子。本研究丰富了多糖合成的理论基础，同时还为有效提高铁皮石斛原球茎多糖含量提供了重要的技术参考。

［1］ CHEN X M，WANG F F，WANG Y Q，et al.Discrimination of the rare medicinal plant Dendrobium officinale based on narin genin，bibenzyl，and polysaccharides［J］.Science China Life Sciences，2012，55（12）：1 092－1 099.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：化学工业出版社，2010：265.

［3］ PAN L H，LI X F，WANG M N，et al.Comparison of hypoglycemic and antioxidative effects of polysaccharides from four different Dendrobiumspecies［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2014，64：420－427.

［4］ MING W，SHENG H W，CHAO Y Y，et al.Effect of putrescine on protocorm－like bodies of Dendrobium officinale to shoots［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2010，102（2）：145－151.

［5］ WEI L W（韦丽文）.XIN N（辛 宁）.LI P T（李培泰），et al.Comparisons of Dendrobium officinale and protocorm－like bodies quality progress［J］.Guide of China Medicine（中国医药指南），2013，11（25）：59－61（in Chinese）.

［6］ GAO J P（高建平），JIN R M（金若敏），WU Y P（吴耀平），et al.Comparative study of tissue cultureddendrobim protoeorm with natural Dendrobium candidumon immunological function［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials（中药材），2002，25（7）：487－489（in Chinese）.

［7］ HE T G（何铁光），YANG L T（杨丽涛），LI Y R（李杨瑞），et al.Physicochemical properties and antitumor activity of polysaccharide DCPP1a－1from suspension－cultured protocorms of Dendrobium candidum［J］.Natural Product Research and Development（天然产物研究与开发），2007，19（4）：578－583（in Chinese）.

［8］ SU J（苏 江），CEN ZH Y（岑忠用），HE T G（何铁光）.Effects of different sucrose concentration of intermittent feed on accumulation of polysaccharides in Dendrobium Candidum［J］.Guangdong Agricultural Sciences（广东农业科学），2010，37（9）：65－67（in Chinese）.

［9］ BAO T F（鲍腾飞），XU B Q（徐步青），WANG F（王 芬），et al.Establishment of suspension culture system ofprotocorm－like bodies for Dendrobium candidum［J］.Journal of Northeast Forestry University（东北林业大学学报），2011，38（12）：49－50（in Chinese）.

［10］ WANG Z L（王增利），SHI H（史 昊），ZHANG ZH SH（张宗申）.Studies on suspension culture of protocorm－like bodies of Dendrobium candidumand their accumulation of polysaccharides［J］.Journal of Henan Agricultural Sciences（河南农业科学），2012，41（2）：129－131（in Chinese）.

［11］ XU B Q（徐步青），CUI Y Y（崔永一），GUO C（郭 岑），et al.Dynamic variation of biomass and content of polysaccharide and alkaloid in protocorm like bodies fromDendrobium officinale at different light intensities and incubation time［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs（中草药），2012，43（2）：355－359（in Chinese）.

［12］ MENG H L（孟衡玲），DUAN CH L（段承俐），XIAO F H（萧凤回），et al.Molecular cloning and expression analysis of sucrose synthase gene from Dendrobium officinale［J］.China Journal of Chinese Materia Medica（中国中药杂志），2011，36（7）：833－837（in Chinese）.

［13］ TENG J B（滕建北），WAN D G（万德光），CAI Y（蔡 毅），et al.Study on dynamics of sucrose synthase activity in Dendrobium officinale［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials（中药材），2012，35（3）：369－371（in Chinese）.

［14］ NACIFDE A I，MAZZAFERA P.Effect of water and temperature stress on the content of active constituents of Hypericum brasiliense Choisy［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2005，43（3）：241－248.

［15］ ARUN K，ESHA A，SUSHMA K，et al.Seasonal low temperature plays an important role in increasing metabolic content of secondary metabolitesin Withania somnifera（L.）Dunal and affects the time of harvesting［J］.Acta Physiol.Plant，2012，34：2 027－2 031.

［16］ BEN Z，LI P Z，JIAN W W，et al.Nitric oxide elicitation for secondary metabolite production in cultured plant cells［J］.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2012，93：455－466.

［17］ WANG J W，Wu J Y.Involvement of nitric oxide in elicitor－induced defense responses and secondary metabolism of Taxus chinensis cells［J］.Nitric Oxide，2004，11（4）：298－306.

［18］ MING ZH，JU F D，HAI H J，et al.Ultraviolet－B－induced flavonoid accumulation in Betula pendulaleaves is dependent upon nitrate reductase－mediated nitric oxide signaling［J］.Tree Physiology，2011，31：798－807.

［19］ MAO J X，JU F D，MU Y Z，JU F D，et al.Effect of nitric oxide on catharanthine production and growth of Catharanthus roseus suspension cells［J］.Biotechnology and Bioengineering，2005，89（3）：367－371

［20］ CAO R X（曹瑞霞），ZHOU X Y（周心渝），LI J J（李姣姣），et al.Effects of exogenous NO on the regulation of secondary metabolism in regenerated Pinellia ternate plantlets［J］.Journal of Southwest University（Nat.Sci.Edi.）（西南大学学报），2013，35（4）：14－19（in Chinese）.

［21］ FU K G，CHENG G R，CHUAN C D，et al.Signaling effects of nitric oxide，aalicylic acid，and reactive oxygen species on isoeuphpekinensin accumulation in Euphorbia pekinensis suspension cells induced by an endophytic fungal elicitor［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2012，31（4）：490－497.

［22］ LI J（李 杰），CHEN K（陈 康），TANG J（唐 静），et al.Relationship between nitric oxide and JA accumulation in maize seedling under NaCl stress［J］.Acta Botanica Boreali－Occidentalia Sinica（西北植物学报），2008，28（8）：1 629－1 636（in Chinese）.

［23］ YE Y Y（叶余原）.Study on polysaccharide extraction process fromDendrobium officinale by ultrasonic［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials（中药材），2009，32（4）：617－620（in Chinese）.

［24］ LI M F（李满飞），XU G J（徐国钧），PING T Y（平田义），et al.Determination of Dendrobiumpolysaccharide content［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs（中草药），1990，21（10）：10－12（in Chinese）.

［25］ 曾 俨.低温下冬小麦糖积累及代谢关键酶表达的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2011.

［26］ DANIEL P P，SAULO P P，MICHAELN，et al.Exogenous influences on plant secondary metabolite levels［J］.Animal Feed Science and Technology，2012，176：5－16.

［27］ WANG B（王 博），PAN L H（潘利华），LUO J P（罗建平），et al.Effect of salicylic acid on cell growth and polysaccharide production in suspension cultures of protocorm－like bodies from Dendrobium huoshanense［J］.Chinese Journal of Biotechnology（生物工程学报），2009，25（7）：1 062－1 068（in Chinese）.

［28］ JIN Q（金 青），YAO Y（姚 瑶），CAI Y P（蔡永萍），et al.Effect of nitric oxide on growth of protocorm－like body and its regeneration culture in Dendrobium［J］.Pharmaceutical Biotechnology（药物生物技术），2012，19（6）：517－520（in Chinese）.

［29］ JIAN W W，LI P ZH，JIAN Y W，et al.Involvement of nitric oxide in oxidative burst，phenylalanine ammonia－lyase activation and taxol production induced by low－energy ultrasound in Taxus yunnanensis cell suspension cultures［J］.Nitric Oxide，2006，15：351－358.

（编辑：裴阿卫）

Effects of Low Temperature and Exogenous Nitric Oxide on Polysaccharide Synthesis in Dendrobium officinale Protocorm

ZHANG Kaihui1，GAO Suping2＊，LIU Shiling1，LI Qiaozi1，ZHANG Keyan1
（1Landscape Architecture College of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2Institute of Landscape Architecture of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

In this paper，we used Dendrobium officinale protocorm as materials and studied the impact of low temperature（4℃），exogenous NO（NO donor SNP），NO scavenger（cPTIO）and nitric oxide synthase inhibitors（PBITU）on NO content，the sucrose synthase（SS）activity，and the content of polysaccharide，sucrose，fructose，glucose in D.officinale protocorm to clear the relationship between low temperature and endogenous NO in the course of polysaccharide synthesis.The results showed that：（1）Under the low temperature（4℃）treatment，the NO content significantly increased，the SS activity enhanced and the content of sucrose，fructose，glucose and polysaccharide increased in D.officinale protocorm.SNP（0.5 mmol·L－1）treatment had the similar effect to the low temperature（4℃）treatment；under the low temperature（4℃）treatment，the SS activity and polysaccharide content increased after a lot of NO produced，sucrose accumulated earlier than fructose and glucose.（2）4℃＋SNP treatment could significantly improve the SS activity，and the content of NO，sucrose，fructose，glucose，polysaccharide in D.officinale protocorm.They were significantly higher 68.04%，96.20%，60.69%，45.64%，66.90%and 67.03%than that of control group，and the effect was better than that in low temperature（4℃）or SNP separate treatments.（3）PBITU could partially inhibit NO production in D.officinale protocorm which induced by low temperature（4℃）and the inhibition rate was 77.15%；it also inhibited the promotion of the SS activity，polysaccharide synthesis and the accumulation of sucrose，fructose，glucose in D.officinale protocorm which induced by low temperature（4℃）.（4）Under SNP＋cPTIO and 4℃＋cPTIO treatments，the SS activity and the content of sucrose，fructose，glucose，polysaccharide and NO in D.officinale protocorm had no significant difference with the control group.Studies had shown that the low temperature and exogenous NO could promote polysaccharide synthesis in D.officinale protocorm，and low temperature induced NO production，the SS activity exaltation and polysaccharide content addition were associated with NO production.In D.officinale protocorm，NO is a necessary signal molecule for its polysaccharide synthesis.

low temperature；nitric oxide；Dendrobium officinale protocorm；polysaccharide；sucrose synthase

Q945.78；Q257

A

1000－4025（2015）08－1626－08

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1626

2015－01－23；修改稿收到日期：2015－06－01

四川省科技计划项目（2012FZ0083）；四川农业大学国家级创新训练项目（201410626015）

张开会（1989－），女，在读硕士研究生，主要从事药用植物次生代谢研究。E－mail：zhangkaihui1989＠126.com

＊通信作者：高素萍，教授，博士生导师，主要从事生态学研究。E－mail：gao＿suping＠yahoo.com