4种东北食用菌内生菌的分离和纯化

2015-02-27 01:46范冬茹张德岩高智涛王丹丽
中国林副特产 2015年5期
关键词:猴头菇黑木耳研磨

范冬茹,张德岩,高智涛,王丹丽

(伊春林业科学院,黑龙江伊春153000)

4种东北食用菌内生菌的分离和纯化

范冬茹,张德岩,高智涛,王丹丽

(伊春林业科学院,黑龙江伊春153000)

从黑木耳、猴头菇、元蘑、榛蘑中分离内生菌,共得到内生真菌7株,内生细菌13株,其中革兰氏阴性菌7株,革兰氏阳性菌6株。猴头菇未分离出内生菌。研磨法为最适分离方法。NB培养基上分离出的内生菌较多,而用来分离内生真菌的PDA培养基仅分离出2株内生真菌,表明其营养成分不适于内生真菌的生长。

食用菌;内生菌;研磨法

从植物中分离内生菌是获得新的天然产物及开发新药的潜在资源,对植物内生菌的研究,具有重大的意义和开发价值。近年来,从蔬菜、花卉、药用植物等多种植物中分离到了大量内生菌,但在现有的报道中,对食用菌内生菌的研究较少。本实验以元蘑、榛蘑、猴头菇和伊春地区产量丰富的黑木耳为研究对象,分离和培养内生菌,开发新的微生物资源。

1 实验材料与方法

1.1 材料

黑木耳、猴头菇采摘于乌马河区为人工栽培种。元蘑、榛蘑采摘于红星区为野生生长菌株。实验对象要求为无霉烂、虫蛀、新鲜的子实体,其中黑木耳应选取背部无筋脉的厚实耳片。

1.2 培养基

用牛肉膏蛋白胨培养基(NB)分离、培养内生细菌;用葡萄糖马铃薯培养基(PDA)分离、培养内生真菌。培养基采用湿热灭菌法灭菌,高压蒸汽灭菌器121℃,维持20min。

1.3 方法

本实验将子实体灭菌之后采用组织分离法、研磨法、印迹法3种方法分离内分菌。在内生菌分离过程中,同时设置超净工作台无菌状态检测、漂洗液检验法、组织印迹法3种对照处理,以确保准确分离食用菌内生菌。具体操作方法如下:

1.3.1 子实体灭菌。在内生菌分离之前,在超净工作台内不同位置放置5个敞开盖子的PDA培养基,做超净工作台无菌状态检测。取新鲜的食用菌,无菌水冲洗5min,滤纸吸干表面水分后,用无菌水冲洗2次,75%乙醇浸泡3min,用无菌水冲洗3次,再用3%NaClO浸泡3min,用无菌水冲洗4次。将处理过的子实体压入PDA培养基中,使子实体与PDA培养基接触20min,移去子实体,做组织印迹法对照。把最后一遍漂洗子实体的无菌水,涂布于PDA培养基上,做漂洗液检验法对照。所有对照平板经28℃培养7天后,不得检出任何杂菌。

1.3.2 内生菌分离

1.3.2.1 印迹法:用无菌解剖刀将灭菌后的食用菌表皮去掉,将内部组织切割成0.5cm的小块,接于NB和PDA培养基上,并用镊子稍稍用力按压,然后将组织块取出。

1.3.2.2 组织分离法:将取出的组织快接于NB和PDA培养基上。

1.3.3.3 研磨法:另取组织块转入研钵中,加入适量灭菌过的石英砂和无菌水进行研磨,静止一段时间后,取上清液在NB和PDA上涂布。

每种方法3个平行。NB培养基于37℃恒温培养24h,PDA培养基于28℃恒温培养72h。纯化,斜面保存菌种。

1.4 统计与鉴别

比较不同分离方法对食用菌内生菌的分离效果。观察内生菌的菌落形态,通过革兰氏染色对分离到的内生细菌形态进行观察、鉴别。

2 结果与分析

2.1 不同分离方法对食用菌内生菌的分离情况

本实验用3种方法对黑木耳、猴头菇、元磨、榛蘑4种食用菌的内生菌进行分离。具体内生菌的分离数量见表1。

表1 不同分离方法对4种食用菌内生菌的分离结果

注:“-”表示未分离到食用菌内生菌

由表1可以看出,研磨法分离得到15株内生菌,组织分离法得到4株内生菌,印迹法分离得到1株内生菌,研磨法的分离效果最好。同时可以看出从榛蘑中分离出的内生菌数量最多,元磨、黑木耳次之。而猴头中并未得到内生菌,可能因其子实体被菌刺覆盖,消毒液沿菌刺进入子实体内部,而影响内生菌的分离。

2.2 不同培养基对食用菌内生菌的分离情况

NB培养基和PDA培养基分离内生细菌和内生真菌的情况见表2。

表2 不同培养基对4种食用菌内生菌的分离结果

由表2可以看出,NB培养基对内生菌的分离效果较好,分离出内生真菌5株,内生细菌9株。PDA培养基分离得到2株内生真菌,4株内生细菌。本次实验中共分离得到7株内生真菌,13株内

生细菌。

2.3 内生细菌的菌落特征及细胞形态

本次实验对内生细菌的菌落特征进行描述,并通过革兰氏染色在显微镜下进行观察,详见表3。

表3 内生细菌菌落特征和细胞形态

3 结论

植物内生菌能产生许多生物活性物质,往往具有抑制病原菌、协助宿主抵抗病原菌和促进宿主植物生长的作用。本实验对黑木耳、猴头菇、元蘑、榛蘑的内生菌进行初步分离,共得到内生真菌7株,内生细菌13株,其中革兰氏阴性菌7株,革兰氏阳性菌6株。猴头菇未分离出内生菌,可能是培养基不适或消毒液浓度过高的原因。3种分离内生菌的方法中,研磨法能使内生菌最大可能地释放出来,分离出的内生菌数量最多,为最适分离方法。NB培养基上分离出的内生菌较多,而用来分离内生真菌的PDA培养基仅分离出2株内生真菌,可能是其营养成分不适于内生真菌的生长。

内生细菌菌数显微镜下观察图

[1]刘丽娟,郝芳芳.白鲜内生菌分离与培养[J].广西农业科学,2012(20):149-150.

[2]张敏星,张灵枝,周游,等. 茶树内生菌的分离和纯化[J].中国茶业,2011(12):12-13.

[3]刘丽娟,贾金如,王洪伟. 紫丁香内生菌分离与培养[J].农村经济与科技,2014(10):39-40.

2015-08-03

范冬茹(1987-),女,助理工程师,主要从事食用菌研究工作,E-mail:124950629@qq.com。

S759.81

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.013

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