利用抑制性PCR提高兼并引物扩增效率及特异性

朱晓静，戴忠敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院发育与再生研究所，浙江 杭州 310036)

利用抑制性PCR提高兼并引物扩增效率及特异性

朱晓静，戴忠敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院发育与再生研究所，浙江 杭州 310036)

摘要：为提高兼并引物PCR的特异性和扩增效率，改进了兼并引物的设计，在兼并引物上加入接头序列，使其延长，并利用该方法成功获得了一个新的聚酮类合成酶的基因片段，表明抑制性PCR能够提高兼并引物扩增的效率及特异性.

关键词：抑制性PCR；兼并引物；分子克隆

克隆非模式生物的基因，往往要先用到兼并引物.兼并引物(亦称简并引物， degenerate primer)，是多种不同但有相关性的引物的混合物.利用基因或其编码的蛋白质在进化上的相关性进行序列比对后，根据保守区域设计的引物，或者根据氨基酸序列设计的引物，一般会有一定的兼并度.利用兼并引物做PCR扩增时，由于兼并引物实际是多种引物的混合物，其中真正能和靶基因序列较好配对的只有少数几种，因此降低了PCR扩增中的有效引物浓度，导致扩增效率下降；同时也会显著提高其与非靶基因序列的配对，导致特异性下降，非靶基因扩增大量增加，当为了提高兼并引物的浓度以提高PCR扩增效率时，这点尤为明显.目前，能够改善兼并引物扩增的方法并不多，Knoth等用次黄嘌呤碱基替代引物中的兼并碱基，能够提高扩增效率[1]，Don等的降落PCR(touchdown PCR)能够减少PCR的条件优化同时提高靶基因的扩增效率[2]，也能提高兼并引物的扩增效率.然而这两种方法都不能完全解决兼并引物自身固有的缺点，其中，次黄嘌呤碱基由于能和不同碱基配对，实际上会增加非特异性扩增，而降落PCR对兼并引物PCR的改善很多时候并不明显.因此，需要一种既高效、又具有特异性的兼并引物PCR扩增方法.

抑制性PCR是一种特殊的PCR，它能利用单引物与待扩增片段的末端反向重复序列结合进行扩增[3].PCR扩增过程中，末端反向重复序列能够互补配对，形成一种类似锅柄状的结构，模板内部的这种配对跟其与引物的配对存在竞争关系，因而会在一定程度上抑制PCR的扩增效率，抑制性作用的强弱受到末端反向重复序列的长度、引物浓度以及退火温度等因素的影响，其中长末端反向重复序列、低引物浓度和低退火温度都能增强抑制性PCR的作用[3].本研究改进兼并引物的设计，将降落PCR与抑制性PCR有机结合起来，以提高兼并引物PCR扩增的特异性和效率.

1材料和方法

1.1　微生物基因组DNA抽提

实验样品为温泉的底泥样品.样品在液氮中研磨后，加入10倍体积的CTAB DNA抽提缓冲液 (100 mmol/L Tris-Cl pH8.0, 10 mmol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl， 2% CTAB)，然后加入0.1 mg/mL的蛋白酶K，55 ℃水浴锅中温浴过夜.加入等体积的苯酚氯仿混匀，10 000 r/min离心10 min，取上清，加入等体积的异丙醇混匀，12 000 r/min离心10 min沉淀DNA，弃上清，加入70%乙醇清洗，12 000 r/min离心5 min，弃上清，风干10 min，加去离子水溶解基因组DNA.

1.2　利用抑制性PCR作用改善兼并引物扩增的原理

提高兼并引物PCR扩增效率和特异性的方法见图1.在兼并引物的5’末端分别加上一段非兼并序列，两条兼并引物上所加的序列不一定与初始模板DNA配对.在PCR扩增目的基因片段时，加入低浓度的兼并引物，同时加入能与兼并引物中的非兼并区域序列相匹配的引物(蓝色或红色表示).这样既能够抑制兼并引物的非特异性扩增，使非兼并引物在两轮PCR循环后就能正常发挥作用，同时也能够提高PCR扩增效率.此外，由于扩增过程中降低了兼并引物的浓度，能够有效降低非特异性扩增.在这种情况下，即使存在非特异性的单引物扩增，本方法由于引物增长，导致末端反向重复序列增长，使抑制性PCR作用增强，也能够达到抑制非特异性产物扩增的作用[3].抑制性PCR的这些特性，可以与降落PCR的最后低退火温度相结合.

图1　抑制性PCR提高兼并引物扩增特异性及效率的原理Fig. 1　Suppression PCR increased the specificity and efficiency of amplification with degenerate primers

1.3　引物设计及PCR

根据GenBank数据库里其它聚酮类合成酶(Polyketide synthase，PKS)基因片段的序列比对(图2)，选择序列保守区，设计带有5’端接头的兼并引物PKSF和PKSR，及接头引物T3P和SP6P.设计的引物序列如下：PKSF (5’- GAATTAACCCTCACTAAAGGGARGCNBHNCARHTNGAYCCNCARCA-3’)， PKSR(5’- GGATTTAGGTGACACTATAGATNCCNGTNCCRTGNVYYTC-3’)，T3P(5’-GAATTAACCCTCACTAAAGGG-3’)， SP6P(5’- GGATTTAGGTGACACTATAGA-3’).在终体积25 μL的PCR反应液中加入10 μmol/L的引物PKSF和PKSR各0.1 μL，再加入10 μmol/L的引物T3P和SP6P各0.5 μL，PCR反应液的其它成分与普通PCR相似.PCR程序如下：首先94 ℃预变性2 min；随后15循环的94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(-1 ℃/循环)，72 ℃ 30 s；然后30循环的94 ℃ 3 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸10 min.

图2　PKS基因兼并引物的设计Fig. 2　Designing degenerate primers for PKS gene

2结果

图3　温泉底泥样品PKS基因片段的扩增Fig. 3　Amplification of PKS genefragment from hot spring sediment

2.1　扩增PKS基因片段

结合降落PCR与抑制性PCR，本研究利用改变设计的引物扩增了温泉底泥样品微生物的PKS基因片段，PCR扩增后的产物经电泳检测，含有目的片段(图3箭头所示，泳道1和2为两次独立PCR).目的片段经切胶回收后，克隆到pUCm-T载体(Sangon Biotech).随机挑选两个用于测序.

2.2　获得PKS基因片段序列分析

两个克隆获得的核酸序列及翻译的氨基酸如图4所示.两个克隆除了其兼并引物区序列不一致外，其余序列相同，证明为同一物种来源的基因片段.将除兼并引物区域的核酸翻译成氨基酸序列后，利用BLASTP与GenBank上的蛋白质序列数据库进行比对，发现其与GenBank上序列号为gb|AAO39790.1|的序列相似度最高，为77%.该序列是一种未知微生物的PKS基因片段，证明本研究获得了新的PKS基因片段.

图4　PKS片段核酸及翻译的氨基酸序列Fig. 4　Amplification of PKS gene fragment from hot spring sediment

3讨论

为了提高兼并引物的扩增效率和特异性，本研究改进了兼并引物的设计方法，延长了兼并引物，使其5’增加了一段接头序列，利用该接头序列相匹配的引物，可以提高原有兼并引物扩增的效率.同时也由于引入了这段接头序列，使PCR可以在引物浓度较低的条件下进行，提高了PCR扩增的特异性，另一方面，对于产生的非特异性的单引物扩增，则有较强的抑制性PCR作用，降低了非特异性产物的扩增效率.利用该方法，本研究扩增获得了一种新的PKS基因的片段，证明该方法能够实现相似基因的高效扩增.

参考文献:

[1] Knoth K, Roberds S, Poteet C,etal. Highly degenerate, inosine-containing primers specifically amplify rare cDNA using the polymerase chain reaction[J]. Nucleic Acids Research,1988,16(22):10932.

[2] Don R H, Cox P T, Wainwright B J,etal. ‘Touchdown’ PCR to circumvent spurious priming during gene amplification[J]. Nucleic Acids Research,1991,19(14):4008.

[3] Dai Z M, Zhu X J, Chen Q,etal. PCR-suppression effect: kinetic analysis and application to representative or long-molecule biased PCR-based amplification of complex samples[J]. Journal of Biotechnology,2007,128(3):435-443.

Enhance the Amplification Efficiency and Specificity of Degenerate Primers

with Suppression PCR

ZHU Xiaojing, DAI Zhongmin

(Institute of Developmental and Regenerative Biology, College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University,

Hangzhou 310036, China)

Abstract:To enhance the specificity and efficiency of degenerate primer PCR, the design of degenerate primer was improved, adaptor sequences were added to the degenerate primer to prolong it. And a DNA fragment of a novel polyketide synthase gene was obtained by this method, which indicates that suppression PCR can be used to enhance the amplification efficiency and specificity of the degenerate primer.

Key words:PCR suppression effect; degenerate primer; molecular cloning

文章编号:1674-232X(2015)06-0581-04

中图分类号:Q781

文献标志码:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.06.005

通信作者：戴忠敏(1981—)，男，助理研究员，博士，主要从事发育及分子生物学研究.E-mail：zhongmindai@hznu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金青年项目(31101642,31201090).

收稿日期：2015-01-26