萜类化合物生物合成途径中关键酶的研究进展

马转转，庞潇卿，谌　容，裴晓林，王秋岩，谢　恬，殷晓浦

(1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036； 2.杭州师范大学医学院，浙江 杭州 310036；

3.杭州师范大学材料与化学化工学院,浙江 杭州 310036)

萜类化合物生物合成途径中关键酶的研究进展

马转转1，庞潇卿1，谌容2，裴晓林3，王秋岩3，谢恬2，殷晓浦3

(1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036； 2.杭州师范大学医学院，浙江 杭州 310036；

3.杭州师范大学材料与化学化工学院,浙江 杭州 310036)

摘要：萜类化合物作为一种广泛存在的天然产物，在植物生命活动中发挥着重要作用，在医药和工业等领域也有着重要应用.它有甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖-5-磷酸途径两条生物合成途径，羟甲基戊二酰CoA还原酶、1-脱氧木糖-5-磷酸合酶、1-脱氧木糖-5-磷酸还原异构酶、异戊烯基转移酶及萜烯合酶是这两条途径中调控萜类合成的关键酶.文章综述了这些关键酶基因克隆、表达、分类、作用机制及代谢调控等方面的研究进展.

关键词：萜类化合物；生物合成；关键酶

萜类化合物，又被称为类异戊二烯，是广泛存在于自然界中的一类天然有机化合物.目前已知的萜类化合物有5万多种[1]，根据结构中包含的异戊二烯单元数量可将其分为单萜、倍半萜、二萜和三萜等，也可根据其碳环数分为链萜、单环萜、双环萜和三环萜等.

有些萜类化合物具有药理活性，如来自短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中的紫杉醇具有抗癌活性；来自中草药丹参(Salviamiltiorrhiza)的丹参酮类化合物则同时具有抗菌、消炎和抗癌作用[2]；来自樟树(Cinnamomumcamphora)挥发油的樟脑在医学上常被用作强心剂和刺激剂.有些植物萜类化合物则因其芳香特质成为食品工业和化妆品工业不可或缺的重要原料，如玫瑰精油、大蒜素等.还有些萜类化合物是植物生长发育所必需的，如类胡萝卜素可参与光合作用[3]；赤霉素作为广泛存在的植物激素可促使根茎生长；固醇则是细胞膜的主要组成成分.此外，部分萜类化合物在调节植物与环境的相互作用方面也发挥着重要作用，如某些挥发性萜类物质对外来入侵者具有防御和毒害作用[4].

萜类化合物虽然种类繁多、分布广泛，但大多为次生代谢产物，因含量较低、提取困难、耗费自然资源巨大等缺点限制了其工业化大规模生产.目前，萜类化合物主要有3种生产方法：植物提取法[5]、化学合成法[6]和微生物发酵法[7].其中，植物提取法容易严重破坏及浪费野生植物资源；化学合成法工艺流程复杂且污染大；而微生物发酵法因不受原料的限制、生产过程环保清洁等特点，具有很大的应用前景，通过该方法提高萜类化合物的产量已成为研究热点.因此，在萜类化合物的生物合成途径已基本明晰的情况下，通过基因工程手段对一些关键酶进行克隆和特性分析，进而作为下一步改造的基础显得尤为重要.本文概述了萜类化合物生物合成途径中的关键酶种类及其研究进展.

1萜类化合物的合成途径

在生物体中，萜类化合物的合成途径有两条：甲羟戊酸途径(mevalonate pathway，MVA)[8]和脱氧木酮糖-5-磷酸途径(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP)[9].前者主要发生在真核生物的细胞质中，后者则存在于原核生物和植物的质体中.这两条途径主要分为3个阶段：第一阶段是中间体异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethy-lallyl pyrophosphate，DMAPP)的生成.第二阶段是3种直接前体物质香叶基二磷酸(geranyl diphosphate，GPP)、法呢基二磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)和香叶基香叶基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)的合成.第三阶段是萜类的形成及其骨架修饰.

MVA途径是以乙酰辅酶A为原料，通过前体物质甲羟戊酸形成IPP和DMAPP，然后在聚异戊二烯焦磷酸合酶(polyisoprenyl diphpsphate synthase)的作用下，IPP和DMAPP进一步缩合形成倍半萜、三萜和甾体(图1A).因反应均在细胞质中进行，故又称为细胞质途径.

DXP途径，又称甲基赤藓醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途径，则是以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸为原料，在1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)的作用下聚合形成DXP，然后在1-脱氧木糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-lxylulose-5-phosphate reductoisomer-ase，DXR)的催化下形成MEP，再经过磷酸化、环化等步骤生成IPP，从而缩合成单萜、二萜等萜类化合物(图1B).

ATOT(acetoacetyl-CoA thiolase)：乙酰乙酰CoA硫解酶；HMGS(3-hydroxy-3-methylglutary-l CoA synthase)：羟甲基戊二酰CoA合酶；HMGR(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase)：羟甲基戊二酰CoA还原酶；MK(mevalonate kinase)：MVA激酶；PMK(phosphomevalonate kinase)：二氧磷基MVA激酶；MPD(mevalonate pyrophosphate decarboxylase)：MVA 焦磷酸脱羧酶；CMS(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-eryt-hritol synthase)：4-磷酸胞苷-2-甲基赤藓醇合酶；CMK(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase)：4-磷酸胞苷-2-甲基赤藓糖激酶；MCS(2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase)：2-甲基赤藓糖-2,4-环二磷酸合酶；HDS(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate synthase)：1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-二磷酸合酶；IPK(isopentenyl monophosphate kinase)：异戊烯基单磷酸激酶；IDI(isopentenyl diphosphate isomerase)：异戊烯基二磷酸异构酶.图1　萜类化合物的两种生物合成途径Fig. 1　Two pathways of isoprenoids biosynthesis

无论是MVA还是DXP途径，IPP都是所有萜类化合物合成的中心前体[10].在异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase，IDI)的作用下IPP部分转化为DMAPP，二者经香叶基二磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase，GPPS)催化头尾缩合形成具有C10骨架的GPP，GPP和一分子IPP在法呢基二磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FPPS)催化下形成具有C15骨架的FPP，FPP和一分子IPP在香叶基香叶基二磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)作用下最终形成具有C20骨架的GGPP(图1).

3种直接前体物质GPP、FPP和GGPP合成后，在不同的萜类合成酶(terpene synthase，TPS)作用下分别生成相应的单萜、倍半萜和二萜.最后通过各种修饰酶的甲基化、羟基化、糖基化等骨架修饰作用形成结构和功能各异的萜类化合物.

2萜类化合物生物合成途径中的关键酶

目前，萜类化合物生物合成途径已基本阐明，参与该过程的相关酶的克隆、表达和调控及其在细胞代谢中的作用等已成为研究热点.迄今为止，已有包括烟草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、红豆杉(Taxuschinensis)、冷杉(Abiesgrandis)、棉花(Gossypiumarboretum)等在内的30多种植物萜类合成酶的cDNA得到克隆.研究较多的酶主要有以下几类.

2.1　羟甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)

HMGR催化3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)不可逆地生成MVA，是甾醇和类异戊二烯生物合成途径中的第一个限速酶，也是动物、真菌等萜类代谢过程中的关键调控位点[11].

HMGR是一个高度保守的膜结合蛋白，通过序列比对可将其分为两类[12]：第一类跟人的HMGR非常相似，利用NADPH作为电子供体；另一类主要存在于真细菌中，为NADH依赖型.区分两类HMGR的主要特征是位于第一类HMGR 682～694氨基酸区间的一个严格保守序列形成的“cis-loop”结构[13].研究表明，HMGR是由hmgr-1、hmgr-2、hmgr-3这3个基因组成的基因家族所编码，且基因家族不同成员的表达量影响MVA途径中“碳流”的变化，决定了各种萜类最终产物的比例.Hampton等[14]研究发现，出芽酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组有两个hmgr基因：hmg1和hmg2，二者的氨基酸序列在N端膜结合域和C端催化结构域分别有着44%和95%的一致性.hmg1编码的Hmg1p蛋白较稳定，而hmg2编码的Hmg2p则很快降解，且二者由不同的反馈抑制方式调控.早期研究表明，HMG1蛋白催化结构域(tHMG1)的过量表达可提高萜类产量[15]，最近报道则显示，在酵母表达系统中，HMG1的N端跨膜结构域对其活性维持来说是必不可少的，缺失其N端跨膜结构域的酵母突变体产生的异戊烯醇和正常酵母菌株相比产量明显下降[16].

2.2　1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(DXS)

DXS是MEP生物合成途径中的第一个关键酶，也是潜在的新型抗生素、抗疟疾药及除草剂[17].目前，已从一些高等植物及大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)等中克隆得到dxs基因.

Xiang等[18]已于2006年成功获得DXS的晶体结构，它包含3个功能域(I、II、III)，活性位点位于功能域I和II单体表面，作为辅酶的焦磷酸硫胺素则大部分埋于复合体中.2014年，Wang等[19]首次从牛巴贝斯虫(Babesiabovis)中分离了一个野生型dxs基因并进行了原核表达.牛巴贝斯虫是一种在热带、亚热带地区发现的红细胞内寄生原虫，可引起牛的贫血、血红蛋白尿甚至死亡.该寄生原虫体内存在一种与质体相似的细胞器——顶质体，可为虫体提供前体物质，参与脂肪酸、血红素和萜类的生物合成.MEP途径是牛巴贝斯虫所特有的类异戊二烯酸代谢途径[20]，一些化合物及其衍生物通过抑制该途径的第一个限速酶DXS从而对病原菌发挥抑菌作用.因此，对牛巴贝斯虫DXS的研究可在一定程度上加快抗巴贝斯虫药物的研发进展，最终减少热带、亚热带地区畜牧业的经济损失.

2.3　 1-脱氧木糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)

DXR参与MEP途径的第二步反应，催化直链的DXP形成带有支链的MEP，是该途径的限速酶，也是进行调控的有效靶点[21].1998年，Takahashi等[22]首次从大肠杆菌中成功分离出了dxr基因，并通过基因工程手段获得了大肠杆菌的DXR蛋白.2002年，Reuter等[23]通过大肠杆菌XL1-blue pREP菌株表达DXR，晶体结构分析发现，该酶是一个同源二聚体，每个单体呈“V”形，由N端的NADPH结合域、C端4个α-螺旋域及连接N端和C端的中心催化域3部分构成.其中，中心催化域起着二聚化作用，包含二价金属离子及底物结合位点.NADPH结合序列中的两个甘氨酸在DXR催化过程中也起着重要作用，将14位的甘氨酸突变成天冬氨酸后，DXR变为不可溶性蛋白.

与细菌来源的DXR相比，植物DXR的特殊性在于其N端有一段可引导DXR定位于质体的转运肽.现已从多种植物中分离克隆到dxr基因，多序列比对表明，不同植物DXR的核酸及氨基酸序列之间具有较高的同源性，都具有维持DXR活性的典型的多肽位点，即两个DXR结合序列和两个NADPH结合序列[24].

2.4　异戊烯基转移酶

MVA及DXP/MEP萜类化合物生物合成途径的基本构建过程是链的延伸反应，催化该反应的为异戊烯基转移酶，又称为异丙基二磷酸合酶.它催化IPP及其异构体生成GPP，接着在GPP上依次加入不同数量的IPP单位得到相应的倍半萜、二萜.根据产物的不同，可将其分为3类：GPPS、FPPS和GGPPS.

2.4.1香叶基二磷酸合酶(GPPS)

1999年，Burke等[25]首次从椒样薄荷(Menthapiperita)中分离出由两个不同亚基组成的二聚体GPPS蛋白并得到了其全长cDNA序列，随后拟南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄等植物的gpps基因也相继得到克隆.研究表明，GPPS分布在分泌腺细胞及叶绿体中，含同源二聚体和异源二聚体两种结构，薄荷属(Mentha)植物的GPPS蛋白是由两个大小不同的亚基组成的异源二聚体.

2013年，Rai等[26]从长春花(Catharanthusroseus)中克隆了3个gpps基因，分别编码异源GPPS蛋白的大亚基CrGPPS.LSU和小亚基CrGPPS.SSU及同源二聚体蛋白CrGPPS.研究表明，CrGPPS.LSU是一个既能催化产生GPP又能产生GGPP的双功能酶，而CrGPPS.SSU无活性，二者在大肠杆菌中共表达时可形成有活性的杂聚肽GPPS，该杂聚肽只催化产生GPP.在长春花中，GPPS蛋白对单萜化合物吲哚生物碱(MIAs)的合成可能起着调控作用.因此，了解GPPS的类型及作用对于研究MIAs代谢途径从而提高其产量具有重要意义.

2.4.2法呢基二磷酸合酶(FPPS)

迄今为止，已有包括拟南芥、水稻(Oryzasativa)、棉花、橡胶树(Heveabrasiliensis)、青蒿(Artemisiaannua)等多种植物的fpps基因的cDNA被克隆表达，并进行了功能鉴定.经序列比对发现，几种植物fpps基因的氨基酸序列同源性很高，都含2个高度保守的富含天冬氨酸的模块——DDXXD(D为天冬氨酸，X为任意氨基酸)，见图2.Daudonnet等[27]将来源于酿酒酵母的fpps基因导入烟草，发现转基因烟草中FPPS的活性是对照组的12倍，生物固醇和类胡萝卜素的含量也明显增加.此外，将来源于薄荷的fpps基因导入烟草栽培品种K326中，转基因植株FPPS酶活性明显提高，离体叶片赤星病接种、黑胫病活体接种及大田抗病性实验表明，转基因植株抗病性也显著提高，这表明fpps基因在植物抗病基因工程中具有很大的应用潜力[28].

A._thaliana.:Arabidopsis thaliana; A._annua.:Artemisia annua; O._sativa.:Oryza sativa;H._brasiliensis.:Hevea brasiliensis; G._arboreum.:Gossypium arboretum.图2　5种植物法呢基二磷酸合酶的同源性比较及保守序列Fig. 2　Homology analysis and conserved sequences of FPPS from various plants

2.4.3香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)

GGPPS是合成二萜、四萜和多萜的关键酶.目前，ggpps基因已从拟南芥、红豆杉、玉米(Zeamays)、银杏(Ginkgobiloba)等物种中克隆得到，且各物种的核酸及氨基酸序列之间具有较高的一致性.

2012年，李锋等[29]从烟叶中克隆了一个编码GGPPS蛋白的基因Ntggpps3，其cDNA序列全长1 251 bp，ORF长1 092 bp，编码363个氨基酸.该蛋白与其它己知的GGPPS蛋白序列具有很高的一致性，包含GGPPS蛋白典型的两个富含天冬氨酸的区域，蛋白晶体结构分析表明这两个区域可与烯丙基底物相结合，是酶的催化活性位点.

2.5　萜烯合酶(TPS)

TPS也被称为环化酶，根据其功能的不同，可分为单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶3种.

2.5.1单萜合成酶

单萜类化合物主要有链状、环状及其衍生物3种形式，广泛存在于植物挥发油和树脂中，在防御植食性动物、吸引昆虫传粉和增强植物抗病能力等方面发挥着重要作用.自1993年第一个4S-柠檬烯合酶基因从绿薄荷(Menthaspicata)中克隆[30]以来，已获得几十种被子植物和裸子植物的近百个单萜合酶基因.不同的是，裸子植物单萜合成酶的催化作用不仅需要二价金属阳离子Mn2+或Fe2+的参与，还需要单价阳离子(如K+)来激活，最适pH偏碱[31]；而被子植物单萜合成酶只需二价金属阳离子Mn2+或Mg2+参与催化即可，最适pH接近中性[32].单萜合酶在反应中以单体或同型二聚体的形式存在，其N端精氨酸保守区与C端天冬氨酸保守区形成的碳氢键、二硫键等不仅可以维持结构稳定，还起着使GPP异构化为能最终形成环化单萜的中间体的作用.

2.5.2倍半萜合酶

倍半萜合酶主要存在于被子植物和裸子植物的地上组织，只有一小部分存在于根中，并发挥重要作用.目前，已克隆得到拟南芥、青蒿、棉花、白姜花(Hedychiumcoronarium)等高等植物的倍半萜合酶基因.不同植物倍半萜合酶表达部位不同，如猕猴桃(Actinidiachinensis)中倍半萜合酶金合欢烯合酶和大根香叶烯合酶在花中表达比叶中表达量高；姜花倍半萜合酶基因在叶片、萼片、块茎中均有一定程度的表达，在其它部位则无表达.

2013年，Li等[33]从青蒿中克隆到一个倍半萜合酶基因，其cDNA编码546个氨基酸，分子量约为63.8 kDa.该蛋白包含一个典型的DDXXD(DDIYD)序列和一个非典型的倍半萜合酶家族常见的NSE/DTE(NDLAGHKEE)序列.其氨基酸序列与青蒿素生物合成过程中的一个关键酶紫穗槐-4,11-二烯合酶有着很高的一致性.经原核表达和酶活分析，该酶可催化FPP生成α-没药醇，占总产物的92.8%.

2.5.3二萜合酶

二萜合酶是以GGPP为起始底物，催化其形成二萜骨架或终产物，然后通过细胞色素P450对底物结构进行各种修饰(如羟基化、甲基化、异构化)从而生成最终的二萜类化合物.目前已克隆得到20多个二萜合酶基因，主要集中于红豆杉、青蒿、冷杉和棉花等植物.2002年，中国科学家克隆得到了来源于紫杉烷高产细胞系的中国红豆杉紫杉烯合酶基因[34]，并对其进行了原核表达和功能鉴定，分析表明，该红豆杉紫杉烯合酶与太平洋红豆杉紫杉烯合酶有97%的同源性.2006年，Ro等[35]利用来源于火炬松(Pinustaeda)的二萜合酶PtTPS-LAS催化GGPP形成松香二烯、新松香二烯和海松二烯，绿色荧光融合蛋白检测表明，PtTPS-LAS定位于细胞质体中.2012年，Zhou等[36]以酿酒酵母为宿主，将GGPPS(BTS1)和FPPS(ERG20)融合表达，同时融合表达类贝壳杉烯合酶(SmKSL)和柯巴基焦磷酸合酶(SmCPS)两个二萜合酶，在提高次丹参酮二烯产量的同时也减少了副产物的积累.利用15 L规模发酵罐培养重组酵母菌株YJ2X，产量可达到365 mg/L.该研究为药用二萜化合物生物合成途径的解析提供了坚实的基础.

3展望

萜类化合物作为一种重要的天然产物，结构复杂、生物活性广泛，由于植物体内大部分萜类合成相关酶表达量低，且表达具有时空特异性，分离纯化比较困难.因此，在萜类生物合成途径已基本明确的基础上，研究参与合成途径的相关酶，发现更多有益萜类化合物并提高其产量具有非常重要的意义.本课题组已从温郁金(Curcumaaromaticacv. Wenyujin)中成功分离了倍半萜化合物榄香烯生物合成途径中的几个关键酶(HMGR、DXR、DXS)基因的保守片段，与其它植物来源的酶进行序列比对，一致性都在80%以上.接着可通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得5’和3’端序列，经过拼接最终获得基因全长序列，为抗癌新药榄香烯的生物合成及其大规模生产研究提供良好的基础.

目前，设计和改造微生物菌株进行异源表达已被认为是一种获取大量酶以使后续研究得以顺利进行的最有潜力的方法.通过基因工程手段改造细胞代谢途径从而提高萜类产量已有很多成功的例子.如2010年，Leonard等[37]在改造后的大肠杆菌中生产左旋海松二烯，该二萜化合物为银杏内酯类前体，其产量高达700 mg/L.2013年，Paddon等[38]通过酵母工程菌生产青蒿素前体青蒿酸，该倍半萜产量高达25 g/L.但萜类化合物整个合成代谢途径涉及多种酶，除了已得到证实的用途外，酶的潜在新功能及彼此之间有无相互作用尚不明确，还需进一步研究.

有证据表明，细胞质中的MVA途径和质体中的DXP/MEP途径并非完全不相关，二者之间部分中间代谢产物(如IPP)可通过质体膜进行交换，该交换作用跟质体膜上的某些转运蛋白有关.但是，两者如何交换，其他的中间代谢产物是否同样存在交换现象等问题尚不清楚.此外，目前有关萜类的研究大都集中在拟南芥、水稻、番茄及棉花等模式植物及部分经济作物上，而不少具有潜在生物活性物质的植物，如一些多年生果树及中药类作物等，相关方面的研究鲜见报道，有待于进一步深入研究.

参考文献:

[1] Poulter C D. Farnesyl diphosphate synthase. A paradigm for understanding structure and function relationships in e-polyprenyl diphosphate synthases[J]. Phytochem Rev，2006,5(1):17-26.

[2] Dai Z，Liu Y，Huang L，etal. Production of miltiradiene by metabolically engineered saccharomyces cerevisiae[J]. Biotechnol Bioeng，2012,109(11):2845-2853.

[3] Gomez-Garcia M del R，Ochoa-Alejo N. Biochemistry and molecular biology of carotenoid biosynthesis in chili peppers (Capsicumspp.)[J]. Int J Mol Sci，2013,14(9):19025-19053.

[4] Beale M H，Birkett M A，Bruce T J，etal. Aphid alarm pheromone produced by transgenic plants affects aphid and parasitoid behavior[J]. Proc Natl Acad Sci，2006,103(27):10509-10513.

[5] Chen M，Zhang M，Sun S，etal. A new triterpene from the fruiting bodies of ganoderma lucidum[J]. Acta Pharm Sin，2009,44(7):768-770.

[7] Ro D K，Paradise E M，Ouellet M，etal. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast[J]. Nature，2006,440(7086):940-943.

[8] Newman J D, Chappell J. Isoprenoid biosynthesis in plants:carbon partitioning within the cytoplasmic pathway[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol，1999,34(2):95-106.

[9] Rohmer M. The discovery of a mevalonate-independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher plants[J]. Nat Prod Rep，1999,16(5):565-574.

[10] Enfissi E M A，Fraser P D，Lois L M，etal. Metabolic engineering of the mevalonate and non-mevalonate isopentenyl diphosphate-forming pathways for the production of health-promoting isoprenoids in tomato[J]. Plant Biotechnology Jorunal，2005,3(1):17-27.

[11] Goldstein J L，Brown M S. Regulation of the mevalonate pathway[J]. Nature，1990,343(6257):425-430.

[12] Istvan E S. Bacterial and mammalian HMG-CoA reductases: related enzymes with distinct architectures[J]. Curr Opin Struct Biol，2001,11(6):746-751.

[13] Istvan E S, Deisenhofer J. The structure of the catalytic portion of human HMG-CoA reductase[J]. Biochim Biophys Acta，2000,1529(1/2/3):9-18.

[14] Hampton R, Dimster-denk D, Rine J. The biology of HMG-CoA reductase: the pros of contra-regulation[J]. Trends Biochem Sci，1996,21(4):140-145.

[15] Donald K A，Hampton R Y，Fritz I B. Effect of overproduction of the catalytic domain of 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme a reductase on squalene synthesis in saccharomyces cerevisiae[J]. Appl Environ Microbiol，1997,63(9)：3341-3344.

[16] Ohto C，Muramatsu M，Obata S，etal. Overexpression of the gene encoding HMG-CoA reductase in saccharomyces cerevisiae for production of prenyl alcohols[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2009,82(5):837-845.

[17] Rodriguez-Concepcion M. The MEP pathway: a new target for the development of herbicides, antibiotics and antimalarial drugs[J]. Curr Pharm Des，2004,10(19):2391-2400.

[18] Xiang S，Usunow G，Lange G，etal. Crystal structure of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase, a crucial enzyme for isoprenoids biosynthesis[J]. J Biol Chem，2007,282(4):2676-2682.

[19] Wang J，Shen Y M，Li B，etal. Characterization of a functionally active recombinant 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase fromBabesiabovis[J]. J Vet Med Sci，2014,76(7):1021-1027.

[20] Hunter W N. Isoprenoid precursor biosynthesis offers potential targets for drug discovery against diseases caused by apicomplexan parasites[J]. Curr Top Med Chem，2011,11(16):2048-2059.

[21] Singh N，Cheve G，Avery M A，etal. Targeting the methyl erythritol phosphate (MEP) pathway for novel antimalarial, antibacterial and herbicidal drug discovery: inhibition of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) enzyme[J]. Curr Pharm Des，2007,13(11):1161-1177.

[22] Takahashi S，Kuzuyama T，Watanabe H，etal. A 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-c-methyl-d-erythritol 4-phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis[J]. Proc Natl Acad Sci，1998,95(17):9879-9884.

[23] Reuter K，Sanderbrand S，Jomaa H，etal. Crystal structure of 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase, a crucial enzyme in the non-mevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis[J]. J Biol Chem，2002,277(7):5378-5384.

[24] Lange B M，Croteau R. Isoprenoid biosynthesis via a mevalonate-independent pathway in plants: cloning and heterologous expression of 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase from peppermint[J]. Arch Biochem Biophys，1999,365(1):170-174.

[25] Burke C C，Wildung M R，Croteau R. Geranyl diphosphate synthase: cloning, expression, and characterization of this prenyltransferase as a heterodimer[J]. Proc Natl Acad Sci，1999,96(23):13062-13067.

[26] Rai A，Smita S S，Singh A K，etal. Heteromeric and homomeric geranyl diphosphate synthases fromCatharanthusroseusand their role in monoterpene indole alkaloid biosynthesis[J]. Mol Plant，2013,6(5):1531-1549.

[27] Daudonnet S，Karst F，Tourte Y. Expression of the farnesyldiphosphate synthase gene of saccharomyces cerevisiae in tobacco[J].Mol Breed，1997,3(2):137-145.

[28] 刘海礁.法呢基焦磷酸合酶基因(fps)转化烟草的研究[D].郑州：河南农业大学,2006.

[29] 李锋，李明，金立锋，等.烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析[J].烟草科技，2012(5):60-64.

[30] Colby S M，Alonso W R，Katahira E J，etal. 4S-limonene synthase from the oil glands of spearmint (Mentha spicata). cDNA isolation, characterization, and bacterial expression of the catalytically active monoterpene cyclase[J]. J Biol Chem，1993,268(31):23016-23024.

[31] Bohlmann J，Steele C L，Croteau R. Monoterpene synthases from grand fir (Abiesgrandis): cDNA isolation, characterization, and functional expression of myrcene synthase, (-)-(4S)-limonene synthase, and (-)-(1S,5S)-pinene synthase[J]. J Biol Chem，1997,272(35):21784-21792.

[32] Alonso W R, Croteau R. Purification and characterization of the monoterpene cyclase γ-terpinene synthase fromThymusvulgaris[J]. Arch Biochem Biophys，1991,286(2):511-517.

[33] Li J X，Fang X，Zhao Q，etal. Rational engineering of plasticity residues of sesquiterpene synthases fromArtemisiaannua: product specificity and catalytic efficiency[J]. Biochem J，2013,451(3):417-426.

[34] 王伟.一.中国红豆杉紫杉醇生物合成基因的研究;二.银杏二萜环化酶克隆的初步研究[D].北京:中国协和医科大学,2002.

[35] Ro D K，Bohlmann J. Diterpene resin acid biosynthesis in loblolly pine (Pinustaeda): functional characterization of abietadiene/levopimaradiene synthase (PtTPS-LAS) cDNA and subcellular targeting of PtTPS-LAS and abietadienol/abietadienal oxidase (PtAO, CYP720B1)[J]. Phytochemistry，2006,67(15):1572-1578.

[36] Zhou Y J， Gao W， Rong Q X，etal. Modular pathway engineering of diterpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradiene production[J]. J Am Chem Soc，2012,134(6):3234-3241.

[37] Leonard E，Ajikumar P K，Thayer K，etal. Combining metabolic and protein engineering of a terpenoid biosynthetic pathway for overproduction and selectivity control[J]. Proc Natl Acad Sci，2010,107(31):13654-13659.

[38] Paddon C J，Westfall P J，Pitera D J，etal. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin[J]. Nature，2013,496(7446):528-532.

Research Advances of Key Enzymes in the Biosynthesis Pathways of Isoprenoids

MA Zhuanzhuan1, PANG Xiaoqing1, CHEN Rong2, PEI Xiaolin3, WANG Qiuyan3, XIE Tian2,

YIN Xiaopu3

(1.College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China； 2.School of Medicine，

Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 3.College of Material, Chemistry and Chemical Engineering，

Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:Isoprenoids are a large and diverse group of natural products which play important roles in plant metabolic activities. They are also widely used in medicine and industry field, which are synthesized via two distinct pathways, the mevalonate pathway and the 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway. 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase(HMGR),1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(DXS), 1-deoxy-D-lxylulose-5-phosphate reductoiso-merase(DXR), isopentenyl transferases and terpene synthases are the key enzymes that regulate isoprenoids synthesis in the two pathways. The research advances of molecular cloning, genetic expression, classification, metabolism and metabolic engineering of these key enzymes were reviewed.

Key words:isoprenoids; biosynthesis; key enzymes

文章编号:1674-232X(2015)06-0608-08

中图分类号:Q55

文献标志码:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.06.010

通信作者：殷晓浦(1980—)，男，助理研究员，博士，主要从事生物催化研究.E-mail：yinxp@hznu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金项目(21206024)；浙江省自然科学基金项目(Y15B060012, Q15C020008, Y15B060045)；杭州市重大科技专项(20142013A63)；杭州市科技发展计划项目(20130432B05).

收稿日期：2015-02-09