HPLC法与EMIT法测定人血中甲氨蝶呤血药浓度差异分析*

唐 茜，孙鲁宁，沈 燕，张宏文，陆 超，龚晓健，王永庆**

1中国药科大学药理教研室，南京 210009；南京医科大学第一附属医院2临床药理研究室，3儿科，南京210029

HPLC法与EMIT法测定人血中甲氨蝶呤血药浓度差异分析*

唐 茜1，2，孙鲁宁2，沈 燕3，张宏文2，陆 超3，龚晓健1**，王永庆2**

1中国药科大学药理教研室，南京 210009；南京医科大学第一附属医院2临床药理研究室，3儿科，南京210029

目的：比较酶增强免疫分析法（EMIT）和高效液相色谱法（HPLC）测定甲氨蝶呤（MTX）血药浓度结果，并分析两种测定方法所得结果存在偏差的原因。方法：7例骨肉瘤患者，采用大剂量（10 g·m-2）甲氨蝶呤静脉滴注后，同时采用EMIT法和HPLC法测定血浆中MTX药物浓度，并对结果进行比较。结果：骨肉瘤患者给药后48、60、96 h的血药浓度，采用EMIT法测得的值约是HPLC法测得值的1.72倍；采用EMIT法测得的血药浓度远远低于HPLC法测得的MTX及其代谢物7-羟基甲氨喋呤 （7-OHMTX）的浓度之和。结论：MTX的主要代谢物7-OHMTX与EMIT法检测MTX存在显著的交叉反应，这可能造成EMIT法测定结果高于HPLC法。

酶增强免疫法；高效液相色谱法；甲氨蝶呤；7-羟基甲氨喋呤血药浓度

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）为叶酸类抗肿瘤药，通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，推迟和阻碍DNA和RNA的合成而发挥抗肿瘤作用[1]。MTX在体内代谢的个体差异较大，其疗效、毒性均与使用剂量相关，因此HDMTX-CF化疗风险很大，必须通过监测MTX血药浓度，及时调整MTX使用剂量和亚叶酸钙的解救剂量，在确保疗效的同时防止严重毒副反应的发生[2]。

目前测定甲氨蝶呤血药浓度的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）和酶增强免疫法（EMIT）、液质联用法等[3-4]。HPLC法专一性强，可将药物与代谢产物分离，是检测MTX血药浓度常用方法[4-5]。酶免疫增强法（EMIT）是一种均相酶免疫分析技术，检测是基于样本中的药物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 （G-6-PDH）标记的半抗原竞争抗体结合位点，与抗体结合后，酶的活性降低，可以根据酶的活性来确定样本中待测物的浓度[6]；该法专属性不强，不能区分MTX及其活性代谢物的各自浓度，而且需要使用仪器配套试剂盒，价格较昂贵，且线性范围较窄，如遇到高浓度样本时需要稀释重新检测，从而增加检测成本及实验时间[7]。本文通过2种方法测定同一份样本，比较各自的浓度差异，从而为临床合理用药提供参考。

1 材 料

1.1 仪器和试剂

Agilent Technologies 1290 Infinity高效液相色谱仪；VIVA全自动免疫分析仪（美国德灵公司）。

甲氨蝶呤（纯度：99.4%，批号：100138-201104，中国食品药品检定研究院）；7-羟基甲氨蝶呤 （纯度：98%，批号：11-THT-2-1，Toronto Research Chemicals Inc.）；替硝唑 （纯度：99.9%，批号：100336-200703，中国食品药品检定研究院）；甲醇（批号：707172，Merck公司）、乙腈 （批号：711922，Merck公司）、甲酸（批号：E1404004，Aladdin indus-trial corporation）均为色谱纯。

1.2 样本的收集

收集2013年9月至2014年9月南京医科大学第一附属医院儿科使用大剂量（10 g·m-2）甲氨蝶呤的7例骨肉瘤患者的血样，时间点为给药后48、60、96 h。

2 方 法

2.1 HPLC法

2.1.1 色谱条件 ZORABX Eclipse Plus C18分析柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：0.25%甲酸-乙腈（95∶5，v/v）；柱温：35℃；流速：1 mL·min-1；检测波长：305 nm。

2.1.2 样本处理步骤 （1）将肝素抗凝的全血样本于8000 r·min-1离心8 min，取上清液300 μL。（2）加入内标液替硝唑30 μL（50 ng·mL-1），涡旋混匀。（3）加入甲醇150 μL，乙腈1 mL，于2000 r·min-1涡旋10 min，16000 r·min-1离心15 min。（4）取上清液，置于离心浓缩仪，45℃，3.5 h，吹干。（5）在吹干后的各试管中加入 0.1%甲酸溶液200 μL，涡旋5 min，16000r·min-1离心15min。（6）取上清液，进样20μL。

2.1.3 标准曲线的建立 精密吸取MTX及7-OHMTX混合标准储备液（100 μg·mL-1）适量，分别加入空白血浆，使甲氨蝶呤及7-OHMTX浓度为0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg·mL-1的模拟血浆样品，按“2.1.2样本处理步骤”操作，以MTX或7-OHMTX的血药浓度为C，MTX或7-OHMTX与内标替硝唑的峰面积比值为f作回归分析，得标准曲线方程。MTX的线性方程为：f1=0.006+0.304C（r= 0.9940）；7-OHMTX的线性方程为：f2=0.000+0.256C（r=0.9930）。本法两者的最低检测限均为0.03 μg· mL-1。

2.1.4 精密度及准确度测定 分别取高、中、低3种浓度的MTX及7-OHMTX的质控品，分别于同日和不同日测定日内、日间RSD并考察其准确度（见表1）。

表1 HPLC法测定MTX和7-OHMTX的准确度和精密度

2.1.5 稳定性试验 取高、中、低3种浓度的质控样本，分别考察其室温、放置24 h的稳定性，-80℃冷冻保存7天的稳定性，反复冻融2次的稳定性，结果无明显变化，相对标准差（RSD）＜15%。

2.2 EMIT法

使用德灵公司的VIVA全自动免疫分析仪，按照仪器标准操作规范，每批次样本测定时随行质控品平行测定。结果见表2。

2.3 数据统计分析

研究结果表明，骨肉瘤患者开始给药后48、60、96 h使用EMIT法测得的血药浓度约是HPLC法测得MTX值的1.72倍；EMIT法测得的血药浓度远远低于HPLC法测得的MTX及其代谢物7-OHMTX浓度之和。HPLC法测得的7-OHMTX血药浓度通常是MTX浓度的十几倍甚至更高。见表3。

表2 EMIT法测定MTX的准确度和精密度

表3 骨肉瘤患者给予MTX 48、60、96 h后血药浓度两种方法测定结果比较（n=5）

3 讨 论

VIVA全自动免疫分析仪带有自动取样系统和良好控温系统及数据处理与贮存器，具有自动化程度高、样本用量少、样本不需要预处理的优点，适用于急诊和大样本的分析测定。HPLC法可将药物和体内代谢物良好分离，仪器精密度好，但操作时程长，特别是血浆样品前处理较繁琐。但由于EMIT法是利用抗原、抗体相互识别并结合来产生检测信号，当某些抗原具有与待测药物相同的抗原表面标志或者抗体有着多个抗原结合位点时，可导致抗体与那些化学结构相近于母体的代谢产物及样本中的内源性物质产生交叉反应，其结果会出现偏差。从测定的结果分析，采用EMIT法测定的MTX血药浓度明显高于采用HPLC-UV法。MTX在细胞外主要代谢成7-OHMTX和一些4-氨基-4-脱氧-N10-甲基喋酸（DAMPA），尽管这些代谢物与二氢叶酸还原酶的亲和力更低，但因为它们与MTX的相似结构，在EMIT法测定时会干扰MTX的浓度测定[8-9]。在肝脏中大量的MTX被乙醛氧化酶氧化，产生7-OHMTX。7-OHMTX的血药浓度可能会超过MTX，尤其在使用大剂量MTX的患者体内，在给药后10～12 h 7-OHMTX成为最主要的代谢物。该代谢物与MTX相比对二氢叶酸还原酶的亲和力更低，但它的多聚谷氨酸盐衍生物抑制胸苷酸合酶和二氢叶酸还原酶的效能，却与MTX多聚谷氨酸不相上下。7-OHMTX因其缓慢的消除率能够减弱MTX的疗效，同时在细胞水平，通过与MTX竞争细胞摄取和细胞内的多聚谷氨酸化，甚至可引起对MTX的抵抗[10-11]。而且 EMIT测出的浓度主要也是 MTX和 7-OHMTX的浓度之和，这很可能就是EMIT法测得的MTX血药浓度高于HPLC法测得值的原因。

[1] 任秀华，杜 光，刘 东.液相色谱-串联质谱法测定人血浆中甲氨蝶呤的血药浓度及其临床应用[J].中国医院药学杂志，2014，34（10）：801-4.

[2] 蔡 讯，林 峰，赵 晖，等.骨肉瘤化疗中甲氨蝶呤血药浓度测定及影响因素分析[J].中国癌症杂志，2007，17（10）：762-5.

[3] 李惠芬，许 俐.高效液相色谱法测定甲氨蝶呤血药浓度[J].天津医药，2003，31（7）：446-7.

[4] 张媛媛，徐康康.三种检测方法测定甲氨蝶呤血药浓度的比较分析[J].安徽医药，2014，18（2）：357-60.

[5] 余 勤，梁茂植，向 瑾，等.EMIT法和HPLC法监测苯妥英和苯巴比妥血药浓度比较研究 [J].检验医学，2007，22（4）：455-8.

[6] 黄成琼，马传学，朱清华.EMIT法和HPLC法监测环孢菌素A血药浓度比较研究 [J].药学与临床研究，2009，17（2）：104-6.

[7] 黄文莺，王长连，刘亦伟，等.EMIT法与HPLC法测定人血中丙戊酸浓度的比较 [J].中国当代医药，2011，18（27）：5-7.

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Comparison of EMIT and HPLC Method in Monitoring Methotrexate in Osteosarcoma Patients Blood*

TANG Qian1,2,SUN Lu-ning2,SHEN Yan3,ZHANG Hong-wen2,LU Chao3, GONG Xiao-jian1**,WANG Yong-qing2**
1China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Research Division of Clinical Pharmacology,3Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University,Nanjing 210029

Objective:To compare the results of plasma methotrexate (MTX)concentrations determined by enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT)and high performance liquid chromatography(HPLC) method in osteosarcoma patients.Methods:Seven patients received large-dose(10 g·m-2)MTX through in-travenous infusion.Plasma MTX levels were evaluated by EMIT and HPLC for comparison.Results:Plas-ma MTX concentrations determined by EMIT after the administration for 48,60 and 96 h were about 1.72 times of those by HPLC method.MTX levels determined by EMIT were lower than the total concentrations of MTX and 7-Hydroxymethotrexate (7-OHMTX)determined by HPLC.Conclusion:7-OHMTX,which is the major plasma metabolite of MTX,has cross-reactivity with MTX when determined by EMIT,and may influence the concentration results of MTX measured by EMIT.

Enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT);High performance liquid chromatogra-phy(HPLC);7-Hydroxymethotrexate methotrexate;Plasma concentration

R969.1

A

1673-7806（2015）02-141-03

江苏省医疗器械重点项目（BM2011017）；江苏省卫生厅医学重点人才项目（RC201170，H201108）

唐茜，女，硕士 E-mail:452022435@qq.com

* *通讯作者龚晓健，男，副教授 E-mail:gongxj99@163.com王永庆，男，主任药师 E-mail:wyqjsph@163.com

2014-10-24

2014-12-11