姜黄素对大鼠慢性脑缺血诱发脑损伤的保护作用及分子机制研究

杨 柳，张 敏，贺 曦，朱 洁，王进平，孟 涛

（重庆市急救医疗中心神经内科，重庆 400014）

姜黄素对大鼠慢性脑缺血诱发脑损伤的保护作用及分子机制研究

杨 柳，张 敏，贺 曦，朱 洁，王进平，孟 涛

（重庆市急救医疗中心神经内科，重庆 400014）

目的观察姜黄脑素对缺血后海马组织中细胞色素C以及caspase-3蛋白的表达情况，探讨姜黄素发挥其神经保护作用的机制。方法将50只SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、正常对照组、缺血后二甲基亚砜（DMSO）干预对照组、姜黄素高剂量组（100 mg／kg）和姜黄素低剂量组（50 mg／kg）。所有治疗组于术后24 h开始以姜黄素每日腹腔注射，连续28 d。给药结束后，对各组进行Morris水迷宫试验测试大鼠空间学习和记忆能力，然后处死大鼠，用HE染色和尼氏染色观察海马组织的病理形态变化，Western-Blot法检测海马组织中细胞色素C和capase-3蛋白的表达情况。结果与各对照组比较，姜黄素明显增强了慢性脑缺血大鼠的空间学习和记忆能力，而且明显减轻了神经细胞的凋亡。Western-Blot法检测到姜黄素使海马组织中细胞色素 C和caspase-3蛋白表达水平明显降低（P＜0．05）。结论姜黄素对慢性大脑缺血诱发脑损伤有明显的神经保护作用，其机制可能是通过细胞色素C途径抑制caspase-3蛋白的表达而发挥作用。

姜黄素；慢性脑缺血；细胞色素C；细胞凋亡

血管性痴呆（VD）是老年人群常见的痴呆类型之一，是一类与脑血管因素有关的痴呆，通常以各种脑血管疾病导致脑组织损伤引起的认知功能障碍为临床特征。目前认为，慢性脑血流灌注不足引起的脑缺血缺氧是诱发VD发生的重要原因[1]。而在慢性脑缺血过程中，神经元的凋亡对损伤脑组织发挥着重要的作用，是引起VD认知功能障碍的重要机制[2]。因此，研究和寻找安全有效的抗凋亡药物具有很强的现实意义。姜黄素（curcumin）是一种黄色粉末状的天然植物化合物，是由植物姜黄的根茎中提取，已被证实具有抗炎症[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]等多种生物学效应，而对正常组织细胞几乎无毒性[6]。近年来已有研究证实，姜黄素具有抗大鼠脑缺血损伤的作用，但多数研究集中于其对急性脑缺血-再灌注导致脑损伤的保护作用和机制，对其在慢性脑缺血损伤中的作用及相关机制尚不清楚。因此，本研究中拟通过建立慢性脑缺血的大鼠模型，并观察姜黄素对慢性脑缺血的神经保护作用，从而探讨姜黄素可能的保护机制，并为防治VD提供新的理论依据。

1 材料和方法

1．1 材料

动物：SPF级Sprague-Dawley大鼠，雄性，体重200～300 g，

由重庆医科大学动物实验中心提供[许可证号为 SCXK（渝）2007-0001]；试验开始前将大鼠置室温恒定（20～25℃）的实验室适应性饲养7～10 d，给予充足的普通饲料和水，饮食自由摄取；造模手术开始前禁食12 h，可自由饮水。

试药：姜黄素购自美国Sigma公司，称取10 mg，用二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）溶解，形成母液；PRO-PREPTM蛋白提取液购自北京赛百盛基因技术有限公司；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Page RulerTMPrestained Protein ladder来自美国 Fermentas公司；PVDF膜购自美国 Millipore公司。Cyto C和 caspase-3兔抗大鼠一抗来源于 Cell Signaling公司；内参兔抗β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗均来自北京博鳌森生物技术有限公司；ECL发光试剂盒购自美国Bio-rad公司。

1．2 试验方法

1．2．1 动物分组与药物处理

选用SPF级Sprague-Dawley大鼠50只，雄性，体重200～300g，将其随机分为5组，即正常对照组（A组）、假手术组（B组）、缺血后 DMSO干预对照组（C组）、药物治疗组（D组），D组又分为高剂量组（D1组，100 mg／kg）和低剂量组（D2组，50 mg／kg），每组10只。D组于术后24 h开始以100 mg／kg和50 mg／kg的剂量腹腔注射姜黄素。A组、B组、C组用等量的DMSO腹腔注射，每日1次，不间断给药28 d。

1．2．2 慢性脑缺血模型制备（2VO式）

采用 Liu等[7]介绍的经典方法复制大鼠慢性脑缺血模型[7]。造模手术开始前大鼠禁食12 h，可自由饮水。用3．5%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉成功后，将大鼠仰卧固定，颈部备皮并消毒，用无菌手术器械沿颈正中切开皮肤及皮下组织，长度约1．5 cm，暴露颈部肌肉，分别沿两侧颈前肌肉和侧方肌肉间隙钝性分离双侧颈总动脉，分别结扎两侧颈总动脉，结扎血管后间断缝合皮肤，缝合完毕，酒精消毒切口，完成慢性脑缺血模型。B组只分离双侧颈总动脉而不结扎，其余过程相同。

1．2．3 Morris水迷宫试验

空间定位航行试验：于各组大鼠给药28 d后进行。参照水迷宫原理[8]，试验共测试5 d。从第1天到第5天，试验开始前允许先将大鼠放在平台上停留20 s，然后每天将大鼠分别从Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ象限的固定入水点入水，入水时使大鼠背对水池壁缓慢放入水中，防止其看到水下平台位置。入水的同时由摄像机连接电脑，记录2 min内大鼠找到平台的时间（即逃避潜伏期）、路程和游泳速度。大鼠找到平台并爬上平台停留3 s及3 s以上，电脑系统自动停止计时，此时该象限试验结束。若大鼠在2 min内仍没有找到平台，则将其逃避潜伏期计为2 min，并引导该大鼠找到平台同时在平台上停留15 s。

空间探索试验：第5天做完空间定位航行试验后撤去水下平台，将大鼠从第Ⅲ象限的入水点放入水中，记录其穿越原平台所在位置的次数和原平台所在象限的路程（即轨迹）长度。

1．2．4 形态学检测

HE染色：取经石蜡包埋切片后的脑组织切片，依次作二甲苯透明、酒精脱水、苏木素染色、盐酸酒精分化、伊红染色、酒精脱水、二甲苯透明等操作，用中性树胶封片。

尼氏染色：脑组织切片按以上过程常规脱蜡，将脱蜡好的切片用蒸馏水冲洗后浸入1%的甲苯胺蓝溶液中，室温下浸染30 min；切片置蒸馏水中冲洗，以酒精梯度脱水、二甲苯透明，最后以中性树胶封片。

1．2．5 Western-Blot法检测

将处死后大鼠的海马组织迅速取出，加入组织裂解液，碾磨、匀浆、离心后取上清，应用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，以20 μL样品上样，行10%SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（保证样品的含量基本一致），然后将电泳蛋白电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液室温下封闭1 h，加入cyto C（1∶2000），caspase-3（1∶2 000）以及β-actin（1∶500）4℃孵育过夜，加二抗（1∶1 000）室温下孵育2～3 h，显色，曝光洗片。以 β-actin作为内参，凝胶成像系统分析各条带吸光度值，计算各条带与内参条带的吸光度比值作为蛋白半定量分析结果。

1．3 统计学处理

采用SPSS 11．5软件对各组数据进行方差齐性检验，数据均以表示，两样本间均数比较采用SNK-q检验，多组数据间比较采用单因素方差分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 Morris水迷宫试验

结果见表1及图1。经过连续5 d的训练，尽管处理方式不同，但各组大鼠逃避潜伏期随训练次数的增加均呈缩短趋势（图1A），说明大鼠空间学习和记忆能力可伴随训练次数增加而增强。第5天试验结果显示，缺血后C组大鼠逃避潜伏期时间明显高于B组和A组（P＜0．05），表明慢性缺血后大鼠的空间学习能力显著下降；姜黄素治疗后，与C组比较，大鼠的空间学习能力明显得到提高，且呈剂量依赖性（P＜0．05）。为了进一步观察姜黄素对慢性脑缺血大鼠记忆能力的影响，记录了大鼠在原平台所在象限停留时间占总游泳时间的比例，见图1B。结果显示，C组在原平台所在象限停留时间占总游泳时间的比例明显少于B组和A组（P＜0．05），而D1组和D2组则比C组显著延长（P＜0．05），表明姜黄素可增强慢性脑缺血大鼠的记忆能力。

表1 Morris水迷宫试验结果（，s，n=10）

表1 Morris水迷宫试验结果（，s，n=10）

组别A组B组C组D1组D2组给药DMSO等量DMSO等量DMSO等量姜黄素100 mg／kg姜黄素50 mg／kg逃避潜伏期12．83±8．61 14．73±3．73 76．82±2．31 22．29±3．41 33．90±5．42

图1 姜黄素对术后大鼠空间学习和记忆能力的影响

2．2 形态学检测

慢性脑缺血动物模型建立后，与A组和B组比较，HE染色显示海马CA1区大量坏死或凋亡的神经元，锥体细胞也明显丢失，细胞排列紊乱，极为不规则，可见细胞核大量皱缩，胶质细胞也明显增生（图2），尼氏染色显示尼氏小体明显丢失（图3）；而姜黄素处理后，海马CA1区的异常形态学改变得到明显改善，坏死及凋亡的神经元明显减少，细胞排列规整，细胞核形态正常，胶质细胞数量明显减少，健存的神经元和尼氏小体数量也较多，形态完整。

2．3 Western-Blot法检测

结果见图4和图5。与A组和 B组比较，慢性脑缺血大鼠模型建立后，海马组织内cyto C和caspase-3蛋白的表达水平都显著升高（P＜0．05）；经不同剂量的姜黄素处理28 d后，海马组织中cyto C和caspase-3蛋白的表达水平明显受到抑制，且抑制作用随姜黄素的剂量增加而增强，呈浓度依赖性（P＜0．05）。

3 讨论

细胞凋亡作为基本的生命现象，在维持机体自身稳定中起着重要作用，现阶段对其的研究已涉及到生命科学的各个领域，具有十分重要的生物学意义。众所周知，半胱氨酸蛋白酶家族（caspases）是特异性凋亡信号转导分子，它的激活被认为是凋亡发生机制中最关键的环节之一。caspase酶原本身没有活性，必须通过活化才能导致细胞凋亡。线粒体依赖途径则是激活 caspase的主要途径：当受到细胞凋亡信号刺激时，线粒体释放细胞色素C（cytochrome c，Cyto C）至细胞浆中；Cyto C与细胞内存在的一种凋亡细胞蛋白酶激活因子（apoptosis protease activating factor-1，apaf-1）结合，在dATP存在的条件下，发挥其促使细胞凋亡的作用。参与凋亡的caspases包括两类：一类是凋亡启动组，包括caspase-2，8，9，10等；凋亡执行组，包括 caspase-3，6，7等。其中caspase-3是最重要的凋亡执行者之一，参与凋亡途径的最后执行阶段，完成致命性的DNA断裂，直接参与凋亡形态学和生化特征的形成。

图2 姜黄素对受损海马CA1区锥体层细胞形态学变化的影响（HE染色）

图3 姜黄素对受损海马CA1区锥体层细胞形态学变化的影响（尼氏染色）

图4 姜黄素对受损大鼠海马组织内cyto C蛋白表达水平的影响

图5 姜黄素对受损大鼠海马组织内caspase-3的影响

VD是老年性痴呆的常见类型，且往往合并阿尔茨海默病（AD），VD的存在可加重AD患者的病情。从对VD的治疗和预防角度而言，对VD的研究要比AD更有实际价值和意义，故目前许多国内外学者将研究重点转移到VD上来。各种脑血管疾病诱发的脑血流灌注不足是引起VD发生的主要原因。由于脑灌注不足且不能及时恢复正常，导致脑血流量减少，引起脑组织中葡萄糖、活性氧及其他代谢产物的量出现异常，从而造成缺血区域神经元的死亡。在各种实验性脑缺血动物模型中已经证实，凋亡是缺血后神经细胞死亡的主要形式。因此，抑制与细胞凋亡相关的caspases活性，可能对于治疗VD有很高的现实意义和社会价值。

本研究中，采用永久性结扎大鼠双侧颈总动脉的方法来建立慢性脑缺血动物模型。Tsuchiya等[9]的研究显示，采用该方法2．5 h后，大鼠脑血流量立即锐减25% ～87%，1周后由于大鼠脑血管交通支的建立以及其代偿功能，脑血流量又恢复到术前正常时的60% ～75%，并长期维持在这一水平。因此，采用该方法建立的模型更接近人类患病的情况，可将其用于研究因慢性脑缺血导致VD的发病机制和相关治疗药物的筛选。

姜黄素作为咖喱、食品添加剂及传统中药姜黄的主要活性成分，具有多种生物学效应，且毒性低、安全有效，开发前景广阔，备受国内外医学界的密切关注。Jing等[10]发现，姜黄素对局部以及全脑的缺血脑组织均有保护作用。Zhao等[11]发现，在急性缺血-再灌注的大鼠模型中，姜黄素可通过抑制细胞凋亡而发挥脑保护作用。然而，关于姜黄素对慢性脑缺血的保护作用及其机制却尚未见报道。

本研究中通过腹腔注射不同剂量的姜黄素以观察其对慢性脑缺血-再灌注大鼠模型的作用，结果显示，与DMSO处理组大鼠比较，姜黄素处理后能明显缩短大鼠逃避潜伏期，延长大鼠在原平台所在象限的停留时间，且这种效应随着姜黄素浓度的增加而逐渐提高，表明姜黄素能明显改善模型大鼠的空间学习和记忆能力。形态学检测HE染色及尼氏染色结果也显示，姜黄素能明显减轻模型大鼠海马CA1区组织中异常的形态学变化，提示姜黄素对慢性脑缺血诱发的脑损伤也有神经保护作用。进一步的研究结果显示，姜黄素能降低海马组织中凋亡激活通路中重要的因子cyto C和凋亡执行的重要因子capsase-3蛋白表达的水平，且呈剂量依赖效应。

综上所述，姜黄素对慢性脑缺血导致的VD也具有脑保护作用，而抑制 cyto C和caspase-3的表达，抗缺血后神经元的凋亡可能是其保护作用机制之一。由于姜黄素还具有多方面的药理学作用，其抗凋亡机制仍需进一步的研究。

[1]Liu H，Zhang J．Cerebral hypoperfusion and cognitive impairment：the pathogenic role of vascular oxidative stress[J]．Int J Neurosci，2012，122（9）：494-499．

[2]Zhang LM，Jiang CX，Liu DW．Hydrogen sulfide attenuates neuronal injury induced by vascular dementia via inhibiting apoptosis in rats[J]．Neurochem Res，2009，34（11）：1 984-1 992．

[3]Ueki M，Ueno M，Morishita J，et al．Curcumin ameliorates cisplatin-induced nephrotoxicity by inhibiting renal inflammation in mice[J]．J Biosci Bioeng，2013，11（5）：547-551．

[4]Yang Y，Duan W，Liang Z，et al．Curcumin attenuates endothelial cell oxidative stress injury through Notch signaling inhibition[J]．Cell Signal， 2013，25（3）：615-629．

[5]于长秀姜黄素对人食管癌细胞株Eca-109增殖抑制和凋亡诱导的实验研究．[J]．中国药业，2007，16（15）：3-4．

[6]Araújo CC，Leon LL．Biological activities of Curcuma longa L[J]．Mem Inst Oswaldo Cruz，2001，96（5）：723-728．

[7]Liu HX，Zhang JJ，Zheng P，et al．Altered expression of MAP-2，GAP-43，and synaptophysin in the hippocampus of rats with chronic cerebral hypoperfusion correlates with cognitive impairment[J]．Brain Res Mol Brain Res，2005，139（1）：169-177．

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[10]Jing J，Wang W，Sun YJ，et al．Neuroprotective effect of curcumin on focal cerebral ischemia rats by preventing blood-brain barrier damage[J]．Eur J Pharmacol，2007，561(1-3)：54-62．

[11]Zhao J，Yu S，Zheng W，et al．Curcumin improves outcomes and attenuates focal cerebral ischemia injury via antiapoptotic mechanisms in rats[J]．Neurochem Res，2010，35（3）：374-379．

Protective Effects of Curcumin on Brain Injury Induced by Chronic Cerebral Ischemia in Rats and Its M olecular M echanism

Yang Liu，Zhang Min，He Xi，Zhu Jie，Wang Jinping，Meng Tao
（Department of Neurology，Chongqing Emergency Medical Center，Chongqing，China 400014）

Objective To observe the effects of curcumin on the expression of cytochrome C and caspase-3 protein in the hippocampus tissue after ischemia，and to explore the potential mechanism for curcumin playing its neuroprotection role．M ethods 50 Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham-operation group(Sham)，normal control group，bilateral common carotid occlusion（2VO）+ dimethyl sulfoxide（DMSO）intervention control group，curcumin high dose group（100 mg／kg）and curcumin low dose group（50 mg／kg）．All treatment groups were intraperitoneally injected by curcumin with in 24 h after operation for consecutive 28 d．Each group was performed the Morris water maze test for detecting the spatial learning and memory ability after medication．Then the rats were killed and the pathological morphological changes of hippocampus were observed by the hematoxylin and eosin（HE） staining and Nissl staining．Western-Blot was used to detect the expression of cytochrome C and caspase-3 in the hippocampus tissue．Results Compared to the various control groups，curcumin significantly enhanced the spatial learning and memory ability in the chronic ischemic rats and obviously alleviated the apoptosis of nerve cells．The Western-Blot detection showed that curcumin significantly decreased the expression levels of cytochrome C and caspase-3 protein in the hippocampus tissue（P＜0．05）．Conclusion Curcumin has obviously neuroprotective effect on the brain injury induced by chronic cerebral ischemia，its mechanism could be that curcumin might inhibit caspase-3 protein expression through cytochrome C pathway．

curcumin；chronic cerebral ischemia；cytochrome C；cell apoptosis

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2015)04－0031－04

杨柳（1979-），硕士研究生，主治医师，主要从事神经内科工作，(电话)023-63692355；张敏，大学本科，主任医师，主要从事神经内科工作，(电话)023-63692353。

2014－03－20；

2014－09－26)