Toll样受体对缺血性脑卒中的作用及中医药干预*

吴锦萍 李鹏飞综述 张春兵, ，#审校

Toll样受体对缺血性脑卒中的作用及中医药干预*

吴锦萍1李鹏飞2综述 张春兵1, 2，#审校

Toll样受体(TLRs)通过与相应配体结合，通过介导多种信号通路在缺血性脑卒中的病理生理机制中发挥着重要作用。本文综述近年国内外有关TLRs对缺血性脑卒中的作用及中医药干预对脑缺血保护的研究进展。

Toll样受体；缺血性脑卒中；中医药

脑卒中(Stroke)又称脑中风或急性脑血管意外，是一组急性起病，以局灶性弥漫性脑功能缺失为特征的脑血管病[1]。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。缺血性脑卒中约占脑血管病的87%[2]，其中约75%由于血栓栓塞脑血管，使脑血流量减少，导致脑组织缺血缺氧，引起神经细胞功能改变，甚至神经细胞坏死[3]。

研究[4]表明，缺血性脑卒中损伤是一个多环节级联反应过程，主要涉及兴奋性氨基酸神经毒性作用、氧化应激作用、钙离子超载、免疫炎症反应和神经细胞凋亡等。脑缺血后，受损脑组织启动固有性免疫应答和适应性免疫应答，介导炎性细胞活化和炎性介质释放[5-7]，诱导缺血区炎症反应。黏附分子家族如整合素、选择素、免疫球蛋白超家族等介导中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等外周白细胞迁移并浸润于受损脑组织，促进炎性介质如促炎因子白介素(Interleukin，IL)家族、肿瘤坏死因子(Tumor Necross Factor，TNF)、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)、一氧化氮(Nitric Oxide, NO)、活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)等的释放，这些炎性介质能破坏血脑屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)结构，加重缺血脑组织损伤，促进炎性细胞活化与浸润，级联放大炎症损伤。

Toll样受体(Toll-Like Receptors, TLRs)作为进化上保守的分子家族，能够直接识别病原体感染及组织损伤，进而启动免疫应答。TLRs不仅在免疫细胞，也在一些非免疫细胞如神经元上表达，而且在中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)固有免疫应答中发挥重要作用，如脑缺血后小胶质细胞、星形胶质细胞等炎性细胞的活化均需要TLRs信号通路的启动。因此，近年来对TLRs参与缺血性脑卒中炎症反应的观察与研究不断增加和深化。中医药作为临床治疗缺血性脑卒中的重要方法，可多途径、多靶点干预TLRs信号通路，抑制缺血性脑卒中炎症损伤，已成为临床研究的重要课题。

1 TLRs结构及其配体

1.1 TLRs的结构

TLRs是一类模式识别受体(Pattern Recognition Receptors, PRRs)，因与果蝇体内Toll蛋白有高度同源性而得名。目前在人体内已发现10种TLRs(TLR1-10)[8]，TLR11-13只存在于鼠科动物体内，其功能尚未明确[9]。TLRs为Ⅰ类跨膜蛋白受体，由胞内区、跨膜区和胞外区三部分组成。胞内区是由约200个氨基酸组成的高度保守区域，其C端与人IL-1受体家族胞质区高度同源，因而被称为TIR结构域(Toll/IL-1 Receptor Homologous Region)，TIR结构域可介导下游信号通路；LRS N端胞外区形似马蹄，富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich Repeat, LRR)，约含550-980个氨基酸；跨膜区主要由半胱氨酸组成。

1.2 TLRs的相应配体

TLRs主要通过识别外源性与内源性配体启动免疫应答。外源性配体是分布在病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原体上的病原相关分子模式(Pathogen-associated Molecular Paterns,PAMPs)，均直接或间接来源于病原体[10]。TLR2与TLR1、TLR6组成异二聚体，分别识别组成细菌胞壁的三酰脂蛋白和二酰脂蛋白；TLR3可识别宿主细胞内RNA病毒产生的双链RNA(Double Strands RNA，dsRNA)；TLR4主要识别革兰阴性菌的脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)；TLR5识别细菌的鞭毛蛋白；TLR7、TLR8均可识别单链RNA(Single Strands RNA，ssRNA)；TLR9可与细菌和病毒内的非甲基化嘌呤磷酸嘧啶DNA(Cytosine-phosphate-guanine Containing DNA，CPG DNA)结合，激活下游信号通路；TLR10可识别流感病毒[11]。

损伤相关分子模式(Damage-associated Molecular Patterns，DAMPs)是机体在应激、损伤和细胞非凋亡性死亡等情况下释放的内源性分子。TLRs识别DAMPs后，可介导炎症基因的表达，调节组织损伤和修复[12]。TLRs可识别的内源性分子即内源性配体主要包括蛋白分子、脂肪酸分子、脂蛋白、核酸以及蛋白核酸复合物。透明质酸、高迁移率族蛋白(High Mobility Group Box-1，HMGB1)、热休克蛋白60(Heat Shock Protein 60，HSP60)、HSP90可激活TLR2和TLR4。另外，TLR4还能特异性识别表面活性蛋白A、纤维蛋白原、纤维连接蛋白A等。TLR3、7、8、9主要识别dsRNA、ssRNA、DNA等核酸分子[13]。

2 TLRs介导的信号通路

TLRs介导的信号通路主要是髓样分化分子88 (Myeloid Differentiation Factors88，MyD88)依赖信号通路和TIR受体功能区接头介导的干扰素-β(TIR Domain-containing Adaptor-inducing IFN-β，TRIF)依赖信号通路,如图1[14]。

图1 TLR1-9信号通路

2.1 MyD88依赖信号通路

TLRs识别相应配体后，引起胞内域TIR结构域二聚体化，招募具有TIR结构域的接头分子，如MyD88、TRIF、TRIF相关接头分子(TRIF-related ,Adaptor Molecule，TRAM)等。研究发现除TLR3不依赖于MyD88信号通路介导下游信号转导之外，其余TLRs均通过MyD88依赖通路向下游介导核因子-κB(Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of Activated B-cells，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)产生炎性因子[15]。MyD88可被TIR受体结构域的适配蛋白(TIR Domain-containing Adaptor Protein, TIRAP)招募到TLR2、4、5、6中，而TLR7、8、9可不需要中间接头分子，直接招募，并且两者下游信号通路也不同。MyD88被TIRAP招募后，死亡结构域与IL-1受体相关激酶4(Interleukin-1 Receptor Associated Kinase 4，IRAK4)的死亡结构相互作用，诱导IL-1受体相关激酶1(Interleukin-1 Receptor Associated Kinase，IRAK1)自主磷酸化。IRAK1磷酸化可导致TNF受体相关因子6(Tumor Necrosis Factor Receptor-associated Factor6，TRAF6)和E2泛激素蛋白连接酶活化。转化生长因子-β活化酶(Transforming Growth Factor-β Activated Kinase，TAK-1)和TAK结合蛋白(TAK Binding Proteins，TABs)相互作用形成复合体的活化需要TRAF6诱导。活化的TAK-1和TAB复合体可向下激活MAPKp38、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Extracelluar Signal-regulated Kinase1/2，ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶1/2(C-Jun NH2-terminal Kinase，JNK1/2)三条级联通路，同时还可磷酸化IkB (NF-κB抑制酶) 并使之发生降解，导致NF-κB核移位，启动炎性因子的转录。位于核内体的TLR7、8、9直接招募MyD88后，刺激TRAF6活化干扰素调节因子7(Interferon Regulatory Factors7，IRF7)表达，介导Ⅰ型干扰素的产生。

2.2 TRIF依赖信号通路

TLR4通过TRIF与TRIF相关接头分子(TRIF-related Adaptor Molecule,TRAM)相互作用，而TLR3不需要中间接头蛋白，直接作用于TRIF进行信号转导。TRAF3 N端机构与TRIF相互结合后被活化，活化的TRAF3作用于TRAF联合NF-κB激酶 (TRAF Joint NF-κB Kinase，TANK) 结合激酶l (TANK-binding Kinase l，TBKl)/IκB激酶i (IκB Kinase i，IκKi) 复合体，诱导干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factors 3，IRF3)磷酸化并且核内移。活化的IRF3可诱导产生I型IFN-β和炎性因子的表达。TLR4信号通路较为复杂，除了介导TRIF/IRF3信号通路外，还可介导TRIF延迟活化TRAF6，延迟下游MAPK和NF-κB信号传导[16]。

3 TLRs对缺血性脑损伤的作用

3.1 TLRs在脑组织中的表达

TLRs广泛分布于脑组织中，参与脑组织炎症损伤。研究[17]发现TLRs主要分布在抗原提呈细胞如B细胞、树突状细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞等，识别相应配体后启动固有免疫应答，诱导炎症基因的表达。也有研究证实，TLRs还可表达于内源性免疫细胞。Hanke等[18]认为TLR1-TLR9在人脑实质小胶质细胞中均有表达，TLR2、TLR3和TLR9在星形胶质细胞上也有表达。此外，神经元细胞、少突细胞与内皮细胞也可表达TLRs；神经元细胞可表达TLR2、3、4、8和9；在外界刺激时TLR2、4、9可高表达于内皮细胞；少突细胞也可少量表达TLR2、TLR3[19]。因此，TLR可表达在外周及中枢神经的多种免疫细胞及实质细胞上，发挥重要功能。

3.2 TLRs对缺血性脑损伤的作用

目前，国内外对TLRs及其配体介导缺血性脑损伤机制的研究逐渐深入，但是对于TLRs在缺血性脑卒中损伤机制中的作用仍然存在争议。目前研究较多的是TLR2、TLR3、TLR4、TLR9在脑缺血炎症损伤中的作用，本文主要介绍TLR2和TLR4。

3.2.1 TLR2与脑缺血：Ziegler等[20]进行了如下研究，采用脑缺血再灌注小鼠模型，与野生型C57B1/6小鼠相比，TLR2缺陷小鼠炎性细胞CD11b表达及缺血侧神经元损伤显著减少；而阻断TLR2抗体治疗组与对照治疗组脑缺血后梗死面积的减少无显著性差异，但是前者能降低炎性细胞表达和减轻神经元损伤。说明TLR2可介导炎症信号通路，加重脑缺血后炎症损伤。缺血性脑卒中体内实验[21]发现，TLR2缺陷小鼠体内小胶质细胞活化和增殖能力显著降低，炎性细胞CD45/CD11b数量显著减少。TLR2敲除小鼠脑缺血再灌注后梗死面积和死亡率显著减少，可能与敲除TLR2无法活化P13K/Akt信号通路，缺血脑损伤减轻有关[22]。

3.2.2 TLR4与脑缺血： 很多实验研究证实TLR4有介导缺血性脑卒中损伤作用。Suzuki等[23]发现实验小鼠脑室内注射TLRs信号抑制剂瑞沙托维可阻断TLR4下游信号传导。在体内、体外阻断小胶质细胞TLR4的实验表明，阻断TLR4能抑制TNFα、IL-1β、iNOS等炎性因子的表达[24]。因此，阻断TLR4抗体可诱导脑缺血耐受，保护神经功能。Gao 等[25]观察了脑缺血再灌注模型小鼠TLR4抗体阻断不同时间脑组织MyD88的表达，结果显示，TLR4可能通过MyD88依赖途径介导脑缺血再灌注损伤。 Hua 等[26]报道TRIF基因敲除小鼠的NF-κB活性、脑梗死面积和神经功能评分与野生型小鼠无显著性差别，提示TLR4可不依赖于TRIF信号，直接完成MyD88/NF-κB信号传导。Brea 等[27]观察了110例缺血性脑卒中患者预后，发现其与TLR4的表达呈负相关。以上结果显示，TLR4参与缺血性脑卒中的病理过程。

3.2.3 其他TLRs与脑缺血： 除TLR2、TLR4以外，其余TLRs在缺血性脑卒中损伤中的作用仍未明确。Tang等[28]在体内体外实验中发现TLR8可能参与且加重缺血性脑卒中患者的脑组织损伤。Brea等[29]发现TLR7、8的表达与脑卒中患者预后呈负相关，而TLR3和TLR9的表达与脑卒中预后无关。Hyakkoku等[30]也发现TLR3、TLR9与缺血性脑卒中脑组织损伤无明显关联。

3.3 TLRs配体预处理在脑缺血中的作用

脑缺血耐受机制已经成为缺血性脑卒中临床和实验研究的重点，也为临床治疗提供新的途径[31]。TLRs配体预处理作为脑缺血耐受机制之一，可诱导缺血耐受，保护缺血后脑组织损伤。

有研究表明，制备脑缺血再灌注小鼠模型前12h注射TLR2外源性配体三酰脂肽(Pam3CysSerLys4，Pam3CSK4)，可使实验组小鼠脑梗死面积、神经功能评分、脑组织水肿较对照组显著改善，死亡率降低[32]。Chen 等[33]报告TLR2配体预处理可促进PI3K/Akt信号转导，降低NF-κB活性，增加HSP27、HSP70、B细胞淋巴瘤2(B-cell Lymphoma，Bcl2)蛋白表达，从而有效保护脑组织损伤。

Marsh等[34]通过体内、体外实验发现，在脑缺血前给予TLR4外源性配体脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，可活化TRIF/IRF3信号通路，产生抗炎因子IFNβ，抑制脑缺血炎症反应对脑组织的损伤。Vartanian等[35]采用LPS预处理的实验结果与前述相似，共同机制为LPS预处理活化TLR4后，NF-κB活性受到抑制，改变了TLR4信号通路方向，激活了IFN基因表达信号通路，因而拮抗脑缺血后炎症损伤。

Leung等[36]在TNF和Ⅰ型IFN同源受体(IFNAR)缺陷小鼠实验中发现，TLR7配体预处理可介导脑缺血再灌注损伤保护作用，这种介导作用依赖于IFNAR产生抗炎因子IFN。Lu等[37]发现通过合成的TLR9外源性配体含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(Oligodexoxyuncleotides Containing A CpG-motif，CpG-ODN)预处理可诱导缺血性脑损伤耐受，减少脑梗死面积和神经功能损害，降低脑缺血再灌注损伤。

而在缺血性脑卒中发生以后注射人工合成的TLR3配体聚肌胞苷( Polyinosinic :Polycytidylic Acid，Poly I :C )，则可通过TRIF依赖性途径增加抗炎因子IFNβ表达水平，延迟TLR4/MyD88信号转导，减少促炎因子TNFα、IL-1β mRNA表达，减少脑梗死面积，改善脑水肿和神经功能[38]。

4 中医药对脑卒中TLRs信号通路的干预作用

中医资源丰富，经济安全，可以有效预防和治疗缺血性脑卒中。中医药干预脑卒中炎症损伤的TLRs信号通路成为近年研究热点，主要包括中药单体、复方制剂、针灸等中医药干预方式。

4.1 中药单体

刘荷兰等[39]研究发现，川芎嗪可以抑制大鼠脑组织中TLR4和NF-κB基因的表达，抑制TLR4/NF-κB信号通路的传导，下调炎症基因的表达，进而减轻缺血性脑卒中炎症损伤。胡黄连苷Ⅱ亦可干预TLR信号通路，有效改善脑缺血后神经功能障碍和神经细胞坏死[40]。黄芩苷具有清热、燥湿、解毒功效，可抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号中重要分子TLR4、MyD88、NF-κB的表达，减少小胶质细胞活化，降低脑组织损伤[41]。

4.2 复方制剂

补阳还五汤已经广泛应用于气虚血瘀型中风患者的治疗。周赛男等[42]的实验结果显示补阳还五汤干预组TLR4蛋白和其mRNA浓度均低于卒中模型组，表明补阳还五汤是通过干预TLR4信号通路从而减少脑缺血炎症反应。脑塞脉方是以四顾汤为基础研制成的中药复方制剂，主要用于治疗血管闭塞性脉管炎。研究发现，脑缺血再灌注后大鼠经脑塞脉方治疗后，大鼠血清HMGB1、TNFα、IL-1β含量和海马区NF-κB mRNA表达水平较模型组明显降低，表明脑塞脉方具有显著神经保护作用[43]。

4.3 针灸

电针刺激脑卒中模型小鼠后发现受损脑组织中谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸含量和NF-κB水平显著降低，表明电针治疗可以合理调控脑缺血再灌注损伤的炎症信号传导[44]。眼针疗法对脑缺血再灌注损伤也有保护作用，其机制为眼针治疗可使MyD88蛋白的含量显著减少，从而抑制其下游NF-κB信号通路的活化，减少炎性因子对脑组织的损伤[45]。

5 小结与展望

综上所述，TLRs在缺血性脑卒中损伤机制中发挥着重要的作用。TLRs像一把“双刃剑”，一方面介导炎症信号通路释放炎性因子，促进脑卒中；另一方面TLRs配体预处理能保护缺血脑组织神经功能。这为临床治疗缺血性脑卒中提供了新的理论依据。目前的研究大多集中在TLR2和TLR4，而对其它TLRs缺乏全面认识，而且对于MyD88依赖和非依赖途径及其它信号通路活化的精密调控机制也知之甚少。中医药干预缺血性脑卒中TLRs通路的研究已经起步，寄望后续研究能进一步为中医药作用提供新的理论依据和临床经验。

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本文第一作者简介：

吴锦萍(1989-)，女，汉族，硕士研究生，研究方向：中医药治疗脑缺血再灌注损伤

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1南京中医药大学基础医学院，南京 210046；2江苏省中医院，南京中医药大学附属医院检验科，南京 210029;#

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本文2014-12-11收到，2015-02-27修回

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