基于酶促反应动力学的无标准品ELISA抗体滴度定量方法＊

方 成，陈 卓，刘 立，梅志强

（武汉轻工大学：1.医学院移植工程实验室；2.生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的催化效应相结合的一种高特异性和高敏感性的实验技术［1］。在临床诊断、医学研究、食品安全、植物资源、环境监测及生态学等领域广泛应用［2］。ELISA 定量检测试剂盒一般配备已知浓度标准品，通过建立标准曲线进行定量分析［3-4］。可是无标准品半定量检测是探索性研究常使用的方法，许多研究工作处于无标准品，或只比较样品差异度而无需标准品的状态。如果仅以吸光度（absorbance，A）值的差异代表浓度（concenration，C）差异是有缺陷的，因为二者并非线性关系［5-6］。A值来自于某时点（即终点法），使用其定量C值的标准曲线呈S型，符合四参数函数，须使用标准品才能建立［5-6］。动力学定量方法则基于酶促反应最大速度与酶浓度成正比的原理［7-9］，通过测量反应初期底物浓度饱和时A值的变化速度来检测样品的浓度［10-11］。其标准曲线呈直线，在ELISA 定量检测中具有更高的稳定性与准确性，目前其应用较少［6］。本研究以血清抗体检测为例，建立无标准品的动力学ELISA 抗体滴度定量方法。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性封闭群昆明小鼠6 只，8～9 周龄，体质量35～40g，由湖北省实验动物中心提供（许可证号SCXK 鄂2008-0005）。辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自Santa Cruze公司，底物四甲基联苯胺（TMB）购自碧云天公司，iMARK 酶标仪购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 检测方法及分组设计 在96孔酶标板上设置非特异抗体、阴性对照、特异抗体和总抗体4组检测孔。特异抗体检测孔以酸溶性鱼胶原蛋白溶液（10μg／mL）4℃包埋12h，洗板以3%牛血清清蛋白溶液封闭后，加入经胶原蛋白免疫的小鼠（n＝3）血清样本（1∶25）；总抗体孔免除抗原包埋及封闭步骤，目的是将总抗体包埋并作为强阳性对照。阴性对照孔加入的血清样本来自生理盐水注射小鼠（n＝3），目的是显示阴性样本的反应性抗体水平；非特异抗体孔则免除抗原包埋步骤，使用生理盐水注射的小鼠血清，目的是侦测非特异染色水平。每组每样本设3复孔，37 ℃孵育2h，洗板后加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG 抗体，洗板后加入底物TMB显色。用iMARK 酶标仪读取655nmA值。

1.2.2 显色动力学曲线及其拟合 显色底物加入完毕开始计时，立即置于酶标仪进行检测，获得每组检测孔的时间-A值数据。以最小二乘法原理对初期显色动力学数据进行线性拟合［12］。线性拟合的斜率即为A值变化速度（ν＝ΔA／s）。

1.2.3 动力学法ELISA 定量曲线的处理 动力学法ELISA定量的理论基础是底物过量时酶促反应速度与酶浓度成正比［7］。而反应体系中与待测物特异性结合的标记酶浓度与待测物的浓度成正比。因此底物过量时A值变化速度（ν）与待测抗体浓度（C）呈直线关系（图1）。由于非特异染色的存在，即待测抗体浓度为0时其ν值不为零，该直线并不通过原点。为排除非特异染色的影响，设非特异组A值变化速度为ν0，令x＝ν-ν0，则可得到通过原点的直线C＝kx（图1）。设阴性对照组A值变化速度为νC，抗体浓度为CC，则k＝CC／（νC-ν0）。故C＝［CC／（νC-ν0）］×（ν-ν0），公式变换得C／CC＝（ν-ν0）／（νC-ν0），即用ν值可计算待测样本抗体浓度与阴性对照样本抗体浓度的倍比关系，表示了能产生阳性结果的最大稀释倍数（滴度）。数据处理使用Prism（4.00）软件。

图1 非特异组（ν0，0）与阴性对照组（νC，CC）在动力学坐标内的分布

2 结 果

2.1 显色动力学曲线 检测实验样本获得非特异抗体、阴性对照、特异抗体、总抗体4组检测孔的时间-A值数据系列（图2），可以发现5min内时间-A值数据线性趋势较好，而5 min后呈现非线性变化，尤其10 min后变化趋势差异较大。如果使用终点法以A值代表待测抗体浓度具有极大的随意性，在无标准品时也不可能进一步做定量分析。

图2 各组时间-A 值曲线

2.2 动力学曲线拟合 根据酶促反应动力学，底物浓度相对催化酶过量时，酶促反应以最大速度进行，反应速度与催化酶量呈正比。对图2动力学曲线取底物过量的显色早期，线性趋势较好的5min内数据进行线性拟合（图3）。非特异抗体、阴性对照、特异抗体、总抗体4组时间-A值拟合直线的相关系数r2均大于0.99；直线斜率即ν值的拟合结果分别为1.55×10-2、1.95×10-2、7.05×10-2、8.45×10-2。

2.3A值变化速率比反映抗体滴度 根据滴度计算公式，使用拟合ν值计算各组样本的抗体滴度。阴性对照组为1.00，特异抗体组为13.75，总抗体组为17.25。

图3 各组5min内时间-A 值数据线性拟合

3 讨 论

上述动力学ELISA 抗体滴度检测方法解决了2个定量障碍。首先排除了以A值差异代替浓度差异的缺陷，可以准确反映浓度倍比差异。其次适用于无标准品检测，可获得样品能产生阳性结果的最大稀释度。对广泛存在的无标准品半定量分析是可取的方法，具有较好的稳定性与准确性。

阴性对照组与非特异抗体组的数据是基础性的，（νC-ν0）值决定了1倍滴度。本研究中非特异抗体孔免除抗原包埋步骤，使用生理盐水注射小鼠的血清样本，目的是排除血清样本的非特异性黏附，具有校正特异性结合基线的作用。阴性对照孔抗原包埋步骤如常，以生理盐水注射小鼠血清加入，目的是显示阴性样本的反应性抗体水平。本研究建立的方法中非特异组的A值变化速度必须小于阴性对照组的（ν0＜νC）。阴性对照血清尚存在能与抗原结合的低水平特异性抗体或交叉抗体，这是普遍存在的正常情况［13］。如果出现ν0≥νC，需高度怀疑检测抗体的特异性强度，分析并排除导致样品非特异黏附增强的因素。

因为本研究对照动物与免疫动物并非配对设计，在拟合动力学曲线产生ν0与νC两项数据时，宜将样本数据合并处理。而特异抗体、总抗体检测可以每血清样本独立定量，最终能获得组均数与标准差；如果样本数据合并处理则可减少计算量，只获得组均数。阴性对照组和特异抗体组也可以各自设立非特异组，则滴度计算公式为CS／CC＝（νS-νS0）／（νC-νC0）。通常情况下νS0与νC0值应该近乎相等。

在动力学曲线拟合时，基于酶促反应动力学原理，数据系列的选取应符合严格的线性趋势。根据动力学线性拟合结果认定ν值。可以认为数据产生时间越早越好［10］，至少2 个时点检测（即两步法），一般在5 min 内完成［6］。期间需连续振板，保证底物及产物分布匀散［14-15］。样本总抗体检测并非必须设置，因为滴度（T 值）的产生并不依赖样本总抗体数据。但使用该指标计算（Tspecial-Tcontral）／Ttotal，可以反映特异性抗体数量占总抗体数量比例，用来衡量体液免疫反应的相对强度，亦具有一定的分析价值。

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