猪博卡病毒1/2 型NS1 基因与3/4/5 型VP1 基因的双重PCR 检测方法的建立

乔 涵，付朋飞，张 磊，杨兴武，潘鑫龙，郭晓庆，陈红英*

(1.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.河南农业职业学院，河南 郑州 451450)

猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)属于细小病毒亚科、博卡病毒属，为单股线状无囊膜DNA病毒，基因组约5 200 bp[1]。PBoV 于2009 年首次从表现断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的瑞典发病猪群中检出并鉴定[1]。流行病学调查表明，在患有呼吸系统疾病和PMWS 的猪群中PBoV 检出率明显高于健康猪群中检出率[2-5]。同时，从患病仔猪中分离鉴定了多种与腹泻相关的新病毒，其中PBoV在猪群中的高感染率38%以上，已引起了广泛关注[6]。

PBoV 除了与细小病毒科其他成员同有2 个开放阅读框架(ORFl 和ORF2)之外，在ORFl 和ORF2之间还存在第3 个ORF(ORF3)。ORFl 编码1 个与病毒基因复制有关的非结构蛋白质，ORF2 编码2个衣壳蛋白(VP1 和VP2)，ORF3 编码1 个高度磷酸化的功能尚未弄清的非结构性蛋白质。根据ORF2编码的VPl 病毒蛋白的不同，将PBoV 分为5 个型(PBoVl～PBoV5)。PBoV 作为新发现的一种病毒，目前在其致病性、检测方法以及稳定的体外培养系统等方面的研究还比较少，能同时检测5 种基因型的方法更未见报道。本研究根据PBoV1/2 型NS1 基因和3/4/5 型VP1 基因序列的高度保守区域，建立了一种快速和敏感的PBoV 不同基因群的双重PCR检测方法，该方法对PBoV 的病原学流行病调查提供了新的技术支撑。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株及病料样品 猪圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)均由河南农业大学兽医微生物实验室保存。病料采自河南省新郑市某猪场，并由本实验室保存。

1.2 主要试剂 2×Taq MasterMix 购自北京康为世纪生物科技有限公司；AXYGEN DNA 凝胶回收试剂盒购自天驰生物科技有限公司；DNA Marker 和pMD18-T 载体均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计 参考GenBank 中登录的PBoV 基因型序列(HM053693、HM053694、F713714、JF42983)，根据PBoV1/2 型NS1 基因和3/4/5 型VP1 基因序列的高度保守区域，采用Obligo7.0 基因分析软件，设计了两对特异性引物。引物A1/A2(5'-GCGTGTACT GCGACTGCGTGTT-3'/5'-CGACCTGGCGTTTATTAA CCGAGA-3')扩增PBoV1/2，扩增片段长度为327 bp；引物B1/B2(5'-TGGGACACGTTCGACCTGATG-3'/5'-CCTTGATGACCGTGACGTACT-3')扩 增PBoV3/4/5，扩增片段为209 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 单项PCR 扩增 采用蛋白酶K 法提取PBoV DNA。PBoV1/2 和PBoV3/4/5 的单项PCR 扩增反应均采用25 μL 反应体系。反应程序为94 ℃5 min；94 ℃1 min、53 ℃45 s、72 ℃1 min，共35 个循环；72 ℃8 min。PCR 产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 双重PCR 扩增 在PBoV1/2 和PBoV3/4/5 基因的单项PCR 扩增的基础上，采用方阵试验进行了双重PCR 扩增条件优化，分别对双重PCR 反应体系中退火温度、引物间比例、模板量、Taq 酶浓度等条件进行预试验，最终确定最佳的双重PCR 方法的扩增条件。

1.6 双重PCR 的特异性试验 对PBoV 病料样品、PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli 核酸，应用优化的双重PCR 方法分别进行检测，并设无模板系统阴性对照，以验证该方法的特异性。

1.7 双重PCR 的灵敏度试验 采用本实验构建的重组质粒(pMD-PBoV1/2 和pMD-PBoV3/4/5)作为标准阳性对照，检测双重PCR 方法的敏感性。通过紫外分光光度计测定重组质粒的OD260nm和OD280nm值，并根据公式计算重组质粒的纯度和浓度。用去离子水对其10 倍梯度稀释，取2 μL 每个稀释度质粒DNA，按照已建立的双重PCR 方法进行扩增。

1.8 双重PCR 的重复性试验 采用建立的双重PCR 方法，对来自不同地区的3 份阳性病料提取的DNA 重复PCR 扩增3 次，共扩增9 次(3×3)，重复多孔同步检测，考察重复性。

1.9 临床样品检测 从河南省部分规模化猪场采集仔猪腹泻临床样品20 份，健康猪肠道样品10 份，提取DNA，采用建立的双重PCR 检测方法进行扩增，并与单项PCR 检测结果进行比较。

2 结果

2.1 单项PCR 扩增结果 利用两对引物A1/A2 和B1/B2，以各型PBoV DNA 为模板，分别进行PCR扩增，扩增出了约300 bp 和200 bp 的特异性片段(图1)，与预期结果相符。将回收的PCR 产物克隆到pMD18-T 载体中进行测序，结果表明所克隆的PBoV1/2 NS1 基因与参照的HM053693 株序列同源性为96.1 %；PBoV3/4/5 VP1 基因序列与参照的JF71371 株序列同源性为94.7 %，表明PCR 扩增是特异的。

图1 PBoV1/2 和PBoV3/4/5 检测目的基因的PCR 扩增Fig.1 PCR amplifications of the DNA fragments for PBoV1/2 and PBoV3/4/5 detection

2.2 双重PCR 反应条件优化结果 以PBoV DNA为模板，通过方阵试验，最终确定了双重PCR 扩增的最佳条件：PCR 反应体系为模板DNA 3 μL；PBoV1/2 的上、下游引物(25 pmol/μL)各为0.5 μL，PBoV3/4/5 的上、下游引物(25 pmol/μL)各为0.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL，总体积为25 μL。PCR 扩增条件为：94 ℃5 min；95 ℃45 s、53 ℃45 s、72 ℃1 min，35 个循环；72 ℃8 min，4 ℃15 min。

2.3 双重PCR 的特异性试验结果 采用优化的双重PCR 反应条件对多种猪腹泻病病原核酸进行扩增。结果显示，从PBoV 病料中可同时扩增出PBoV1/2 的约300 bp 和PBoV3/4/5 的约200 bp 的2个片段，而PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli及阴性对照均无目的片段(图2)，表明本研究建立的双重PCR 具有良好的特异性。

2.4 双重PCR 的灵敏度试验结果 将23 ng/μL(约109拷贝/μL)的PBoV1/2 重组质粒和31 ng/μL(约1010拷贝/μL)的PBoV3/4/5 重组质粒倍比稀释后进行双重PCR 灵敏性试验。结果显示能够扩增出PBoV1/2 和PBoV3/4/5 重组质粒的最大稀释度为107(图3)。表明双重PCR 对PBoV1/2 的检测下限为102拷贝/μL，对PBoV3/4/5 的检测下限为103拷贝/μL，具有良好的灵敏性。

图2 双重PCR 的特异性试验Fig.2 The specific test of duplex PCR

图3 灵敏性试验结果Fig.3 The sensitivity test of the duplex PCR assay

2.5 双重PCR 的重复性试验结果 采用本实验建立的双重PCR 方法，对来自不同地区的3 份阳性病料提取的DNA 重复PCR 扩增3 次，共扩增9 次(3×3)，每次PCR 扩增结果均为阳性，表明该方法具有很好的可重复性。

2.6 临床样品的检测 应用PBoV1/2 和PBoV3/4/5的单项PCR 方法和本实验建立的双重PCR 方法对来自河南省部分猪场内的30 份猪病料样品进行检测，结果显示，单项PCR 与双重PCR 检测符合率为100%。其中10 份为PBoV1/2 阳性，5 份为PBoV3/4/5 阳性，并且有3 份病料为PBoV1/2 和PBoV3/4/5混合感染(表1)。表明该方法可以用于PBoV 临床鉴别检测。

表1 两种方法对30 份病料样品的PBoV1/2 和PBoV3/4/5检测结果Table 1 The results of 30 samples detected by two methods for PBoV1/2 and PBoV3/4/5

3 讨论

在PBoV 的研究中，针对其基因型分型、致病性、感染性克隆、稳定的体外培养系统、鉴别诊断方法等方面的研究还比较薄弱。在PBoV 检测方面，目前主要采用的是PCR 扩增、荧光定量PCR 扩增技术、环介导等温扩增(LAMP)和间接免疫荧光技术等[7]。双重PCR 法具有快速、特异性高、操作简便、重复性好、一次试验即可同时检测大批量样本等优点。本研究根据GenBank 中登录的PBoV 5 种基因型核苷酸序列设计了两对特异性引物，通过扩增条件优化，建立了PBoV 的双重PCR 检测方法。应用建立的PBoV 的双重PCR 检测方法，检测PBoV 病料样品、PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli 核酸，结果表明，仅PBoV 病料样品中可同时扩增出 2 个片段，而对 PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli 核酸扩增均为阴性，具有良好的特异性；其对PBoV1/2 的检测下限为102拷贝/μL，对PBoV3/4/5 的检测下限为103拷贝/μL，具有良好的敏感性。

应用该方法对2013 年10 月～2014 年5 月间实验室收集的来自河南省的20 份腹泻仔猪病料和10份健康猪病料进行了检测，共检出PBoV 阳性样品15 份，阳性率达到50 %，这与四川、湖北、湖南等省猪场腹泻仔猪中PBoV 检出率相似[7-8]。

本研究建立的双重PCR 方法可以快速检测并区分1/2 和3/4/5 型的PBoV，可用于PBoV1/2 和3/4/5的分型检测及流行病学调查。

[1]McMenamy M J,McKillen J,McNair I,et al.Detection of a porcine boca-like virus in combination with porcine circovirus type 2 genotypes and Torque teno sus virus in pigs from postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)-affected and non-PMWS-affected farms in archival samples from Great Britain[J].Vet Microbiol,2013,164(3-4):293-298.

[3]Huang L,Zhai Shao-lun,Cheung A K,et al.Detection of a novel porcine parvovirus,PPV4,in Chinese swine herds[J].Virol J,2010,7:333.

[4]Madec F,Rose N,Grasland B,et al.Post·weaning multisysremit wasting syndrome and other PCV2-related problems in pigs:a 12-year experience[J].Transbound Emerg Dis,2008,55(7):273-283.

[5]Meng X J.Emerging and re-emerging swine viruses[J].Trambound Emerg Dis,2012,59:85-102.

[6]McKillen J,McNeilly F,Duffy C,et al.Isolation in cell cultures and initial characterisation of two novel bocavirus species from swine in Northern Ireland[J].Vet Microbiol,2011,152(1-2):39-45.

[7]胡军勇，张倩，王丹丹，等.猪博卡病毒PCR 检测方法的建立及其初步流行病学调查[J].中国预防兽医学报，2012，34(8)：632-636.

[8]蔡雨函，朱玲，周远成，等.猪博卡病毒双重PCR 检测方法的建立及其应用[J].中国兽医科学，2013，43(08)：833-838.