猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 抗体检测ELISA 在中和抗体评估中潜在应用的研究

彭 军，郭中坤，杜以军，李 俊，吴家强，于 江,赵鹏伟，邹荣凯，柳 晓，王金宝1,*，朱瑞良

(1.山东农业大学 动物医学学院，山东 泰安 271000；2.山东省农业科学院 畜牧兽医研究所，山东 济南 250100；3.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS 病毒(PRRSV)引起的一种高发病率和死亡率的传染病。该病的主要特征为母猪妊娠后期流产、产死胎和木乃伊胎，以及仔猪呼吸障碍[1]；其中HP-PRRS 感染可以造成50 %～100 %的高发病率和20 %～100 %的高死亡率[2-3]。

有效而准确的诊断是预防与控制该病的重要途径。近年，几种方法相继报道用来检测PRRSV，例如间接免疫荧光试验(IFA)、中和试验(SN)、ELISA和免疫过氧化物酶单层染色法(IPMA)[4-7]。其中，ELISA 因其操作简单和高灵敏度的特点而得到广泛应用。但现有应用广泛的ELISA(例如IDEXXELISA)未能全面、恰当反映猪机体的保护性免疫状况，因为该方法的包被抗原为PRRSV N 蛋白，而抗N 蛋白抗体被证明具有病毒的抗体依赖性增强作用(ADE)[8-9]。研究表明，PRRSV 特异保护性中和表位主要存在于GP5 囊膜糖蛋白[10-12]。因此，本研究采用PRRSV GP5 重组蛋白为包被抗原建立了间接ELISA 方法，用于检测猪血清中抗GP5 抗体，同时评估其检测结果与血清SN 测定结果的相关性，为建立既适合大规模抗体检测，又能够更好地反映猪群保护性免疫状况的ELISA 方法做一有益的探索。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 HP-PRRSV SX1 株ORF5 基因重组质粒pMD-ORF5 由本实验室保存；DH5α 及BL21(DE3)pLysS 感受态细胞购自TransGene 公司；pMD19-T 载体购自TaKaRa 公司；原核表达载体pET-32a(+)购自Novagen 公司；小鼠抗GP5 单克隆抗体(MAb)腹水由中国农业科学院上海兽医研究所童光志研究员惠赠；PRRSV 阳性、阴性猪血清由中国动物疫病预防控制中心惠赠；临床送检猪血清、猪圆环病毒(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)阳性血清均由本实验室制备或保存。Taq DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶和限制性内切酶购自Fermentas 公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒、增强型DAB 显色试剂盒及TMB 单组份底物显色溶液(PA107-01)均购自天根生化科技(北京)有限公司；HRP 标记山羊抗猪IgG(IgG-HRP)和羊抗鼠IgG-HRP 购自Jackson 公司；HisTrapTMHP亲和层析柱购自GE Healthcare 公司；IDEXX-ELISA试剂盒购自IDEXX 公司。

1.2 重组GP5 蛋白表达与鉴定

1.2.1 GP5 基因的克隆及重组表达质粒的构建 根据GenBank 登录的HP-PRRSV SX-1 株(GQ857656.1)ORF5 基因序列设计两对引物(表1)，分别扩增编码GP5 蛋白的aa32～aa60 和aa126～aa200 的基因片段。在相应位点分别加入酶切位点序列和编码4 个氨基酸的连接序列(GGSG)。

以pMD-ORF5 为模板，通过引物GP5-1F/R 和GP5-2F/R，PCR 分别扩增获得编码截去信号肽和跨膜区GP5 蛋白的两个基因片段GP5-1(120 bp)和GP5-2(258 bp)。琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段GP5-1 和GP5-2 并克隆于pMD19-T 载体中，构建重组质粒pMD-GP5-1 和pMD-GP5-2，对其进行PCR和测序鉴定。将GP5-1 和GP5-2 依次亚克隆于pET-32a 载体中，构建重组质粒pET-rORF5；进行酶切和测序鉴定。

表1 扩增2 个GP5 片段的PCR 引物序列Table 1 Sequences of PCR primers for amplifying two fragments of GP5

1.2.2 GP5 蛋白的表达及纯化 将重组质粒pETrORF5 转化于表达宿主菌BL21(DE3)pLysS 中，重组菌pET-rORF5/BL21 经0.1 mM IPTG 诱导，37 ℃200 r/min 培养6 h 后取菌液样品，离心，分别取菌体沉淀和上清液样品，处理后SDS-PAGE 电泳分析GP5 重组蛋白的表达形式。

诱导表达菌液，离心，获得菌体沉淀，经超声波细胞破碎仪破碎菌体，收集包涵体沉淀；用含8 M 尿素的缓冲液孵育溶解包涵体。将上述溶解液进行His 标签亲和层析纯化，获得重组GP5 纯化蛋白。SDS-PAGE 检测纯化前后的蛋白样品，并测定纯化后GP5 蛋白含量。

1.2.3 重组GP5 蛋白的鉴定 将纯化后的GP5 蛋白与空载体宿主菌诱导产物进行12 % SDS-PAGE 凝胶电泳，经半干转印将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜；以小鼠抗PRRSV GP5 MAb(1∶200)为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP 抗体(1∶5 000)为二抗，DAB 显色，蒸馏水终止显色反应，western blot 鉴定重组表达GP5 蛋白的反应原性。

1.3 GP5 抗体检测间接ELISA(rGP5-ELISA)方法的建立

1.3.1 间接ELISA 反应条件优化 利用PBS 将纯化的GP5 蛋白分别稀释至2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL，以100 μL/孔 包被ELISA 反应板(Costar Inc.)；待检血清用封闭液分别作1∶20、1∶40、1∶80、1∶160 稀 释；羊抗猪IgG-HRP 作1∶10 000 倍稀释，加入TMB 底物显色15 min，1 M H2SO4终止反应，通过对应OD450nm的P/N 值大小来确定包被抗原和血清的最佳稀释比例。

分别用PBS 缓冲液和CBS 缓冲液稀释GP5 蛋白，包被ELISA 反应板，按照确定的抗原包被浓度、血清稀释度进行ELISA 试验，选择最佳包被缓冲液。

分别用2.5 % DM/PBST 和1 % BSA/PBST 作为封闭液进行ELISA 试验，选择最佳封闭液。

将羊抗猪IgG-HRP 分别作1∶5 000、1∶8 000、1∶11 000、1∶14 000 倍稀释，进行ELISA 试验，确定最佳的二抗稀释比例。

1.3.2 临界值确定 利用rGP5-ELISA 检测46 份标准PRRSV 阴性猪血清，计算所有样品的吸光度值(OD450nm)平均值(X)与标准差(SD)，临界值按下式计算：临界值(Cut-off value)=X+3SD。

1.3.3 特异性试验 分别将抗PCV2、CSFV、PRV、PPV 和JEV 阳性血清作1∶80 稀释，利用建立的间接ELISA 方法进行检测，测定该方法特异性。

1.3.4 重复性试验 选取4 份不同的临床送检血清样品，每份样品平行做4 孔，采用同批次纯化的rGP5 为包被抗原进行ELISA 试验，检测其组内重复性。同时，选取4 批不同时间纯化的rGP5 抗原包被ELISA 板，进行组间重复性试验。

1.4 rGP5-ELISA 与血清中和抗体水平评估

1.4.1 rGP5-ELISA 与IDEXX-ELISA 检测结果相关性 随机选取288 份临床送检猪血清样品，同时利用rGP5-ELISA 与IDEXX-ELISA 两种方法进行检测。利用SPSS Statistics 13.0 软件计算两种方法测定结果之间的相关系数(R)。

1.4.2 Western blot 复检 以上述两种方法检测结果为基础，选择rGP5-ELISA 检测呈阳性的血清以western blot 试验进行复检，分别计算其对应的真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)、假阴性(FN)比例，分析其阳性及阴性检出的可信度。同时，随机选取上述临床送检血清样品144 份分别以rGP5-ELISA 和western blot 进行检测，计算二种方法的符合率。

1.4.3 SN 试验 为更好地评估rGP5-ELISA 对临床送检猪群血清样品检测结果与血清中和抗体水平的相关性，本研究采用SN 试验测定以上两种ELISA方法检出阳性血清对应的病毒中和能力。按照ELISA 吸光度值由低到高的顺序，以隔一选一的规则选取ELISA 显示阳性的血清，即rGP5-ELISA 对应选择101 份，而IDEXX-ELISA 对应选择133 份。SN 试验参照文献[13]方法进行，中和效价以未出现CPE 孔的最高血清稀释倍数来表示。

2 结果

2.1 GP 5 重组蛋白的表达与鉴定

2.1.1 目的基因的扩增及重组表达质粒的构建 PCR扩增获得目的基因片段GP5-1 与GP5-2，大小约为250 bp 和120 bp，与预期相符(图略)。经基因重组，获得含有基因片段ORF5-1 和ORF5-2 的重组质粒pET-rORF5。DNA 测序鉴定结果表明，重组质粒构建正确。

2.1.2 重组GP5 的表达及鉴定 pET-rORF5/BL21经IPTG 诱导表达，SDS-PAGE 凝胶电泳结果显示，表达的目的蛋白大小约为32 ku，并且重组蛋白GP5在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达。

采用His 标签亲和层析对重组蛋白GP5 进行纯化，NanoDrop 微量测定仪检测纯化后蛋白浓度为13.59 μg/mL(图1A)。

Western blot 试验结果表明，原核表达的GP5重组蛋白能够与小鼠抗GP5 蛋白MAb 发生特异性反应，表明其具有良好的反应原性(图1B)。

2.2 间接ELISA 方法的建立

2.2.1 间接ELISA 反应条件优化 通过方阵试验确定了重组GP5 蛋白包被量和待检血清稀释比例，在此基础上对间接ELISA 各个反应条件进行优化，结果如表2 所示。

2.2.2 临界值确定 采用本研究建立的建立ELISA方法检测46 份标准阴性血清OD450nm值，经计算其和SD 分别为0.2047 和0.0585，临界值为0.3802。判定标准为P/N 值(阳性对照OD450nm/阴性对照OD450nm)>2.1，并且样品OD450nm>0.3802，即为阳 性，否则为阴性。结果正态分布如图2 所示。

表2 间接ELISA 反应条件的优化结果Table 2 The optimized conditions of the indirect ELISA

图2 阴性样品ELISA 结果正态分布图Fig.2 Negative samples normal distribution diagram

2.2.3 特异性分析 采用建立的间接ELISA 方法检测 抗PCV2、CSFV、PRV、PPV 和JEV 阳性血清，结果均为阴性(表3)，表明该方法具有良好的种属特异性。

表3 rGP5-ELISA 检测猪血清的特异性分析Table 3 Specificity of the rGP5-ELISA to anti-sera against swine reproductive obstacle viruses

2.2.4 重复性分析 4 份不同的临床送检血清样品分别进行组内和组间重复性试验，结果显示组内和组间变异系数均小于5.3 %，表明该间接ELISA 具有良好的重复性(表4)。

2.3 rGP5-ELISA 与血清中和抗体水平评估

2.3.1 rGP5-ELISA 与IDEXX-ELISA 检测结果相关性 采用rGP5-ELISA 方法和IDEXX-ELISA 同时对288 份临床送检猪血清进行检测，结果见表5。rGP5-ELISA 检测结果对应的DSP、DSN、Accuracy 分别是75.7 %、76.2 %和75.7 %。两种方法测定结果之间的相关系数(R)为0.831(图3)，表明二者之间相关性较低。

表4 间接ELISA 重复性试验(n=4)Table 4 Repeatability assay for indirect ELISA(n=4)

图3 rGP5-ELISA 与IDEXX-ELISA 相关系数测定Fig.3 Test for the correlation between rGP5-ELISA and IDEXX-ELISA

2.3.2 Western blot 试验 以上述检测结果为基础，选择两种ELISA 检测结果“有争议”的血清以western blot 试验进行复检，结果见表5。同时，rGP5-ELISA 检测随机选取的144 猪血清，阳性率为71.85%，western blot 检测的阳性率为66.87 %，二者的符合率为93.16 %。

表5 rGP5-ELISA 和IDEXX-ELISA 检 测288 份临床血清样品结果比较Table 5 Comparison of the rGP5-ELISA and IDEXX-ELISA for 288 field pig serum samples

2.3.3 SN 试验 本研究采用SN 试验测定rGP5-ELISA 和IDEXX-ELISA 两种方法检出阳性血清对应的病毒中和能力。两种方法检测呈阳性血清对应的中和效价分别为9.4333±0.7002 和7.2030±1.3067；统计分析显示，rGP5-ELISA 检测阳性血清的中和效价显著高于IDEXX-ELISA 检测阳性血清(p<0.01)(图4)。该结果表明rGP5-ELISA 检测呈阳性的血清与中和性标准具有更高的相关性，而IDEXX-ELISA检测呈阳性的血清中包含更多的低中和效价血清。

图4 rGP5-ELISA 和IDEXX-ELISA 检测呈阳性血清的中和效价分析Fig.4 Neutralizing antibody titers of positive sera detected by rGP5-ELISA and IDEXX-ELISA,respectively

3 讨论

PRRS 是危害养猪业最重要的疫病之一，在世界范围内广泛存在；HP-PRRS 于2006 年首次在我国境内发生，是当前流行的主要猪病[2-3,14]。随着自然感染及大量疫苗的使用，PRRS 监测及猪群相应的保护性免疫水平评估成为PRRS 防控的一个重要手段。

本研究建立的rGP5-ELISA 包被抗原由GP5 的两个亲水性片段连接而成，该重组蛋白包含PRRSV和HP-PRRSV C 末端保守序列，可以稳定表达并对传统和高致病性病毒株具有特异性。rGP5-ELISA 与IDEXX-ELISA 对同一批血清样品进行检测，阳性检出率分别是71.88 %(207/288)、92.71 %(267/288)，rGP5-ELISA 明显低于后者。两种方法检测结果具有较低的相关性(R=0.831)，这是由于二者的包被抗原存在差异(分别为GP5 和N 蛋白)。因此，本研究对二者的阴性检出血清进行western blot 复检，相对于western blot 试验结果，rGP5-ELISA 的假阴性率显著低 于IDEXX-ELISA。同 时，rGP5-ELISA 与western blot 两种方法检测同一批血清，二者显示较高的符合率(93.16 %)。

为进一步评估ELISA 阳性检出血清的中和抗体水平，本研究以SN 试验检测两种方法阳性检出血清的中和抗体效价，统计分析显示rGP5-ELISA 检出血清的中和抗体效价显著高于IDEXX-ELISA(p<0.01)，该结果表明rGP5-ELISA 检出阳性血清与保护性中和抗体具有更高的相关性；这与rGP5-ELISA 具有更低的假阴性率是相符合的。已有研究表明PRRSV 特异性中和抗体于免疫或感染后约28 d才可被检测到，并且抗体水平较低；与此相对的是抗N 蛋白抗体在约7 d 即可被检测，并且抗体维持水平高[12,15]。由此可见，rGP5-ELISA 阳性血清检出率低、但具有更高的中和抗体水平与上述理论一致。rGP5-ELISA 在一定程度上可代替操作程序复杂的SN 试验来评估猪群血清中和抗体水平的高低，降低了成本、节省了时间；实际上，该ELISA 方法的功能特点正符合本研究所预期结果。

以上结果表明，本研究建立的rGP5-ELISA 适合大规模检测PRRSV 特异性抗体，同时可更真实地反映由PRRSV 感染或免疫而诱导猪产生的中和抗体水平，从而达到简化评估猪群整体保护性免疫状况的目的，该方法具有进一步研究与开发利用的潜在价值。

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