1株快速增殖的HAV分离株基因型分析

白冰珂，胡 燕，邬顺全，姜棋予，杨瑞创，柴燕涛，李瑞生，侯 俊

HAV属于小RNA病毒科嗜肝病毒属，其基因组为单股正链RNA，全长约7500个核苷酸。HAV开放读码框架编码一个大的前体蛋白，在病毒蛋白酶的作用下裂解产生11个不同大小的具有不同功能的蛋白，包括结构蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4 以及非结构蛋白2A、2B、2C。一般HAV毒株在细胞培养中增殖缓慢，培养周期较长，为HAV灭活疫苗的生产带来不便。我们从一例甲型肝炎患者粪便中分离到1株HAV毒株，该病毒具有在细胞培养中快速增长的特性：其培养周期为13 d，而一般HAV在细胞中的生长周期为1个月。为了解其基因特点，为HAV疫苗生产打基础，本文参照文献报道方法，对HAV302株进行了基因分型并对其编码功能区序列进行分析[1-2]，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病毒和试剂 HAV302株病毒为本室分离鉴定，QIAamp®Viral RNA mini kit购自Qiagen公司（德国凯杰公司），反转录酶SuperscraptШ和Taq酶购自Invitrogen公司（美国英骏公司），T载体购自Promega公司（美国普洛麦格公司），其他试剂均为国产试剂。

1.2 病毒RNA的提取 用QIAamp®Viral RNA minikit提取病毒RNA，具体操作为：取140μl病毒培养液加入含carrierRNA的结合液AVL中，加入无水乙醇后过柱，用AW1、AW2溶液洗柱，14 000 r/m高速离心彻底去除乙醇，最后用洗脱液AVE洗脱病毒RNA。

1.3 反转录-聚合酶链反应（RT－PCR）

1.3.1 VP1/2A区段的 RT-PCR 取 2μl病毒RNA， 以 SuperscraptШ和 引 物 1 （序 列 ：5′-TTTTTTTTTTTTTGGTACCATTTACTGA）进行反转录扩增VP1/2A区段的168个核苷酸（上游引物：5′-GAATCAATGATGAGCAGA，下游引物：5′-AACCCCTTCATTTTCCTA），扩增条件为94℃，2min；94℃，30 s；47℃，30 s；72℃，30 s；扩增 40个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小后进行序列测定。

1.3.2 2B/2C区段的RT-PCR 取2μl病毒RNA，以 SuperscraptШ和引物 1（序列：5′-TTTTTTTTTTTT TGGTACCATTTACTGA）进行反转录扩增2B/2C区段的1326个核苷酸（上游引物：5′-GGTGTTGGATTAATAGCAG，下游引物：5′-CTGAGACCACAACTCCATA），扩增条件为 94℃，2min；94 ℃，30 s；50℃，30 s；72℃，2min；扩增40个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小后进行序列测定。

1.4 引物合成及序列分析 引物合成和核酸序列测定均由Invitrogen公司进行，测序结果用DNA STAR和CLUSTAL序列分析软件进行处理。

1.5 用于序列比较的HAV病毒株的选择 根据Robertson等[1]对世界各地HAV株进行基因分型的结果，结合我国已分离的HAV病毒株基因型，我们从GenBank中选取了7种（Ⅰ～Ⅶ是HAV的7种基因型；ⅠA型和ⅠB型、ⅢA型和ⅢB型为同一基因型Ⅰ型和Ⅲ型的不同亚型）HAV基因型的14个代表毒株，包括PRC16（ⅠA型，GenBank序列号：L07716.1）、PRC37（Ⅰ A 型，GenBank 序 列号：L07717.1）、S85-1（ⅠA 型，GenBank 序 列号：L07715.1）、CHINA81（ⅠA 型，GenBank 序列号：L07712.1）、LCDC-1（ⅠA 型，GenBank 序列号：L07714.1）、MBB（ⅠB 型，GenBank 序列号：M20273.1）、HM175（ⅠB 型，GenBank序列号：U68700.1）、CF-53（Ⅱ型，GenBank序列号：L07693.1）、PA21（ⅢA型，GenBank序列号：L07730.1）、M-25（ⅢB 型，GenBank 序列号：L20544.1）、CY145（Ⅳ型，GenBank序列号：L07732.1）、AGM-27（Ⅴ型，GenBank 序列号 ：D00924.1）、JM55 （Ⅵ 型 ，GenBank 序 列 号 ：L07731.1） 和 SLF88（Ⅶ型，GenBank序列号：L07729.1）。

2 结 果

2.1 VP1/2A区序列的扩增与鉴定 通过RT-PCR成功扩增出目的片段，电泳显示约170 bp，与预计大小相符。

2.2 HAV302株的基因型分析 根据文献报道，以VP1/2A区168个核苷酸序列为HAV基因分型标准[1]，运用DNA STAR软件将 HAV302与 GenBank中收录的其他14株HAV VP1/2A区基因型序列进行比较。结果显示HAV302株与MBB株VP1/2A区序列有1个碱基不同（99C→T），与HM175株有8个碱基不同，而与其他9个病毒株则至少有10个碱基不同（图1）。其相应的氨基酸序列比较显示与MBB株完全一致，而与其他10个病毒株则至少有1个氨基酸不同（图2）。通过分析发现HAV302株与MBB株亲缘性最高，初步推断HAV302株与MBB株属同一亚型，为基因Ⅰ型中的ⅠB亚型[3]。

将除HAV302株的14个病毒株VP1/2A区核苷酸和氨基酸序列用CLUSTAL软件两两进行同源性比较，结果显示不同基因型间的核苷酸同源性为69.6%（117/168）～91.1%（153/168），同一基因型内不同亚型间核苷酸的同源性为 86.9%（146/168）～100%（168/168），同一亚型不同分离株间核苷酸同源性为 94.6%（159/168）～100%（168/168）；而同一基因型内氨基酸序列的同源性为 96.4%（54/56）～100%（56/56），不同基因型之间氨基酸序列的同源性为 83.9%（47/56）～100%（56/56）（表 1）。HAV302株核苷酸序列与MBB株同源性为99.4%，与HM175株同源性为95.2%，与其他病毒株同源性为70.2%～93.5%；其氨基酸序列与MBB株同源性为100%，与其他病毒株同源性为85.7%～98.2%，进一步证实HAV302株与MBB株同属ⅠB亚型。

2.3 不同基因型HAV VP1/2A区序列的进化树分析 在初步判断HAV302株基因型的基础上，将其与从GenBank中选取的7种HAV基因型的14个代表毒株的VP1/2A区核苷酸序列进一步用DNA STAR软件进行进化分析，得到种系发生树（phylogenetic tree）。进化结果分析显示，HAV302株与MBB和HM175株处于进化树的同一进化枝上，同属IB亚型，且与MBB株亲缘关系最近；该病毒株与HAV其他基因型的病毒株进化关系较远（图3）。

2.4 HAV302株编码基因序列的分析 将HAV302株的编码区各基因序列与MBB株相应序列比较，发现2B和2C区核苷酸序列差异最大：其中2B区有4个核苷酸不同，同源性为98.96%（380/384）；2C区有17个核苷酸不同，同源性为98.28%（973/990）。推导的氨基酸序列比较，2B区有2个氨基酸变异，同源性为98.43%（126/128）；2C区有9个氨基酸变异，同源性为97.27%（321/330）。见表2。

3 讨 论

HAV的基因组结构和体外细胞培养特性不同于其他小RNA病毒，其VP1/2A连接物不被病毒蛋白酶裂解，而由细胞内的蛋白酶将2A蛋白降解，从而使VP1蛋白释放出来，参与病毒的组装和成熟[4]。VP1/2A连接区VP1的突变可能因影响病毒蛋白加工从而影响病毒的成熟，而2A蛋白则可能和病毒颗粒的组装有关[5]。HAV抗原生产制备采用常规培养法，一般在1个月左右收获病毒，黄丽娟等[6]采用转鼓培养技术将HAV的培养时间缩短到18 d即可收获病毒，其HAV抗原滴度为1∶8。我们分离的HAV302株虽然有快速繁殖能力（培养13 d即可收获病毒，抗原滴度达1∶50），但是其VP1/2A区序列和MBB株同源性高达99.4%，而且相应氨基酸序列同源性为100%，表明病毒的快速繁殖与VP1/2A区不相关。而文献报道2B和2C蛋白在整个基因和RNA复制过程中发挥重要作用，即和体外适应细胞培养及有效增殖相关，尤其是2B区的变异可能加快病毒在细胞培养中的生长速度[7]。另据研究报道2B/2C区基因的突变是细胞适应所必需的，2B/2C的协同突变可使HAV适应组织培养，促进病毒繁殖，这可能与2B和2C在细胞中的独特作用有关：2B及其前体2BC蛋白影响着细胞膜的改变，2B蛋白还可以通过阻断干扰素调节因子-3的活化来抑制细胞内干扰素β基因的转录，该机制被认为对病毒的生存至关重要[8-11]。我们在研究过程中也发现HAV302株的2B和2C区变异高于其他蛋白编码区，提示其快速繁殖能力的获得可能在于2B和2C蛋白的变异，尤其是其优势蛋白2B蛋白的变异。但目前该结论仅限于推测阶段，其具体基因功能须在后续的研究中加以证实。

图1 不同HAV病毒株VP1/2A区核苷酸序列比较Figure 1 Comparison of nucleotide sequences covering the adjacent region of VP1/2A fragments among different HAV strains

图2 不同HAV病毒株VP1/2A区氨基酸序列比较Figure 2 Com parison of am ino acid sequences covering the adjacent region of VP1/2A fragments among different HAV strains

HAV基因分型方法及型别的建立，使HAV的流行病学研究从宏观进入到微观分子水平。用HAV基因分型理论分析HAV的流行特征及其流行因素，确定暴发或流行与传染源之间的内在联系，对甲型肝炎的预防和控制具有重要意义。Robertson等[12]以HAV VP1/2A连接区168个核苷酸的不同序列作为分型标准对全球29个国家的152株HAV进行分型比较，发现HAV各型间该区的核苷酸序列同源性为75%～85%，相应的氨基酸序列同源性为82%～97%。我们将HAV302株和其他HAV毒株VP1/2A区的核苷酸和氨基酸序列进行比较，发现该分离株核苷酸序列与MBB株的同源性最高为99.4%，与CY145株的同源性最低为70.2%；相应的氨基酸序列同源性与MBB株最高为100%，同CY145株的同源性最低为85.7%。

表1 HAV302核苷酸序列(VP1/2A，168nt)及相应氨基酸序列(VP1/2A，56aa)同源性比较(%)Table 1 Homology com parison of nucleotide sequences(HAV302 VP1/2A,168nt)and am ino acid sequences(HAV302 VP1/2A,56aa)(%)

图3 HAV302株VP1/2A区遗传进化分析Figure 3 Phylogenetic tree for HAV302 based on the partial sequences of the VP1/2A fragments

表2 HAV302株与MBB株2B、2C区核苷酸及氨基酸序列比较Table 2 Comparison of the homology of nucleotide sequences and am ino acid sequences between HAV302 and MBB 2B and 2C fragments

我国属于HAV高流行区，1992年Roberston等[12]对世界各地HAV株进行基因分型，来自我国的5株病毒均为ⅠA 亚型（PRC16、CHINA81、S85-1、LCDC-1和CHINA83）。但是随着经济的发展和人员交流增多，我国HAV基因型分布也日益多元化，逐渐发展为以ⅠB亚型为主。以往报道的H2株HAV均属于ⅠB亚型[6,13]，而我们分离的这株HAV也属ⅠB亚型。当前预防甲型肝炎发生和流行惟一有效的手段仍是接种疫苗，而目前常用的HAVH2株减毒活疫苗和HM175株灭活疫苗的基因型均为ⅠB亚型，与我们分离的HAV302株相同，而HAV302株拥有的快速繁殖能力则为其改造成高产HAV疫苗及HAV基因功能的进一步研究奠定了基础。

[1]Robertson BH，Khanna B,Nainan OV,et al.Epidemiologic patterns ofwild-type hepatitis A virus determined by genetic variation［J］.J Infect Dis,1991,163(2):286-292.

[2]洪世雯，沈宏辉.引起细胞病变的甲肝病毒BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因序列的测定［J］.传染病信息，2000，13(2):63-64.

[3]Paul AV,Tada H,von der Helm K,et al.The entire nucleotide sequenceof the genome ofhuman hepatitis A virus(isolateMBB)［J］.Virus Res,1987,8(2):153-171.

[4]Totsuka A,Moritsugu Y.Hepatitis A virus proteins［J］.Intervirology,1999,42(2-3):63-68.

[5]Morace G,Kusov Y,Dzagurov G,et al.The unique role of domain 2A of the hepatitis A virus precursor polypeptide P1-2A in viral morphogenesis［J］.BMB Rep,2008,41(9):678-683.

[6]黄丽娟，万卓越，王开利，等.不同细胞系制备甲型肝炎病毒抗原效果的比较［J］.肝脏，1999，4(4):255-256.

[7]Emerson SU,Huang YK,Nguyen H,et al.Identification of VP1/2A and 2C as virulence genes of hepatitis A virus and demonstration of genetic instability of 2C［J］.JVirol,2002,76(17):8551-8559.

[8]井申荣.甲型肝炎病毒的分子生物学研究进展［J］.国外医学：流行病学传染病学分册，2000，27(5):197-201.

[9]Beneduce F,Pisani G,Divizia M,et al.Complete nucleotide sequence of a cytopathic hepatitis A virus strain isolated in Italy［J］.Virus Res,1995,36(2-3):299-303.

[10]Martínez-Gil L,Bañó-Polo M,Redondo N,et al.Membrane in tegration of poliovirus 2B viroporin［J］.J Virol,2011,85(21):11315-11324.

[11]Paulmann D,Magulski T,Schwarz R,et al.Hepatitis A virus protein 2B suppresses beta interferon(IFN)gene transcription by interfering with IFN regulatory factor 3 activation［J］.JGen Virol,2008,89(Pt 7):1593-1604.

[12]Robertson BH,Jansen RW,Khanna B,et al.Genetic relatedness of hepatitis A virus strains recovered from different geographical regions［J］.JGen Virol,1992,73(Pt 6):1365-1377.

[13]黄小琴，周德久.甲肝减毒活疫苗（H2株）接种后HAV的毒力和基因型［J］.中国生物制品学杂志，1998，11(4):200-203.