外源性一氧化碳释放分子2对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用研究*

2015-03-15 06:08刘志刚余化龙湖北医药学院附属东风医院骨科研究所湖北十堰442000
检验医学与临床 2015年8期
关键词:外源性脊髓炎性

刘志刚,熊 敏,余化龙,曾 云(湖北医药学院附属东风医院骨科研究所,湖北十堰 442000)



外源性一氧化碳释放分子2对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用研究*

刘志刚,熊 敏△,余化龙,曾 云(湖北医药学院附属东风医院骨科研究所,湖北十堰 442000)

目的 探讨外源性一氧化碳释放分子2(CORM2)对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用与相关机制。方法 将30只健康雄性Wistar大鼠分为实验组、对照组、空白组,每组各10只。实验组在造模前1 h尾静脉注射外源性CORM2。实验组和对照组采用相同的方法造模。对照组造模后1 h注射与实验组相同剂量的生理盐水。空白组仅完成开腹和关腹操作,并术后1 h注射与实验组相同剂量的生理盐水。在术后不同时间进行神经行为学评分(Tarlov评分)、脊髓组织病理学检查和白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测。结果 再灌注后不同时间点,实验组Tarlov评分均高于对照组,但实验组和对照组Tarlov评分均低于空白组(P<0.05)。缺血再灌注48 h后,对照组脊髓组织标本可见损伤及坏死神经元,表现为细胞核固缩或溶解,细胞质中的尼氏体消失;空白组脊髓组织标本中可见正常神经元,表现为结构呈多角形,细胞质中可见尼氏体;实验组脊髓组织标本中的神经元坏死表现介于对照组和空白组之间。缺血再灌注48 h,实验组与对照组IL-6、TNF-α表达水平均高于空白组,但实验组IL-6、TNF-α表达水平低于对照组(P<0.05)。结论 外源性CORM2可抑制炎性因子的表达,对大鼠脊髓缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

外源性一氧化碳释放分子2; 脊髓缺血再灌注损伤; 白细胞介素-6; 肿瘤坏死因子-α

脊髓缺血是比较危重的疾病,可导致组织失活,乃至死亡[1]。在脊髓缺血的病理生理学发病过程中,对组织造成损伤的主要因素是血液再次灌注后,大量释放的自由基所造成的严重细胞损伤[2]。由于脊髓的神经元细胞对缺血缺氧极为敏感,因此脊髓缺血再灌注损伤极易导致脊髓功能障碍和不可逆性脊髓神经元迟发性死亡[3-4]。一氧化碳(CO)是一种生物信号分子,其活性受到血红素氧合酶(HO)的影响。HO是内源性CO的诱导酶,分为诱导型(HO-1)和结构型(HO-2)[5]。在脊髓组织缺血再灌注损伤过程中,HO-1表达水平明显升高,阻断HO-1则显著加重组织损伤,间接证实CO对于组织缺血再灌注损伤具有保护作用[6-7]。CO可以促使血管平滑肌舒张,降低细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达水平,进而抑制炎性细胞和血小板的聚集和黏附[8]。此外,CO可通过抑制核因子κB(NF-κB)信号途径实现保护效应,抑制炎性介质局部聚集[9]。本研究探讨了外源性一氧化碳释放分子2(CORM2)对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用与相关机制。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠30只,体质量220~260 g,由本院实验动物中心提供。

1.2 仪器与试剂 TB209312型台式冷冻高速离心机购自美国Beckman公司,AB873011型组织机械匀浆机购自上海瑞赛斯仪器有限公司。炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒购自北京华英生物技术研究所,丝裂原活化蛋白激酶P38(MAPK P38)抗体购自碧云天生物技术研究所。经去RNA酶处理的二乙基焦磷酰胺(DEPC)及Trizol试剂购自北京赛百盛生物公司。转录试剂盒、核酸酶抑制剂及Taq酶购自日本宝生物工程有限公司。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用于动脉结扎的0、4、10号爱惜康牌外科缝线购自美国强生公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 将30只Wistar大鼠分为实验组、对照组、空白组,每组各10只。造模前1 h,实验组按照8 mg/kg的剂量尾静脉注射浓度为40 mmol/L的外源性CORM2。对照组及空白组在造模前不进行任何预处理。

1.3.2 动物模型制作 实验组及对照组大鼠经10%水合氯醛麻醉后,仰卧固定。于左侧助骨下缘助中线切口,切口长度5 cm,依次切开皮肤、腹肌后入腹,找到左侧肾后于肾门部位确定肾动脉,沿动脉游离至腹主动脉;分别使用10、4、0号外科缝线结扎动脉,结扎使用活结,留长线头于体外;依次关腹、缝皮后留置线头。于术后30 min、45 min和1 h抽线松节。实验组大鼠造模后不给予任何处理。对照组大鼠术后1 h注射与实验组相同剂量的生理盐水。空白组大鼠麻醉后仅完成开腹及关腹操作,术后1 h注射与实验组相同剂量的生理盐水,不对脊髓及血管进行操作。

1.3.3 观察指标 (1)神经行为学评分:实验组与对照组大鼠在松结后,即再灌注后6、24、48 h,空白组大鼠在术后6、24、48 h,参照Tarlov标准进行神经行为学评分并记录评分结果。0级(0分):无可察觉的后肢活动;1级(1分):有可察觉的微弱后肢活动,但无法对抗重力;2级(2分):后肢能对抗重力,但无法站立;3级(3分):可正常站立、行走,但不能正常跳跃;4级(4分):后肢功能完全恢复,能正常跳跃。(2)组织病理学检测:在完成神经行为学评分后处死大鼠,切除L2~L4椎板,暴露L3~L4节段硬膜囊,切断周围神经根;分离脊髓组织,10%甲醛固定48 h,分节段石蜡包埋、切片,苏木精-伊红(HE)染色后采用光学显微镜及电子显微镜进行观察,计数正常神经元数目,观察神经元损伤情况。(3)炎性因子检测:取部分分离的脊髓组织,研磨、离心处理,提取细胞成分,给予刺激后检测IL-6、TNF-α表达水平。IL-6、TNF-α检测严格按照试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 造模情况 在再灌注48 h后进行组织病理学检测,结果显示,对照组组织标本镜下可见损伤及坏死神经元,表现为细胞核固缩或溶解,细胞质中的尼氏体消失;空白组组织标本镜下可见正常神经元,表现为细胞呈多角形,细胞核结构清晰,细胞质中可见尼氏体;实验组组织标本坏死神经元的表现介于对照组与空白组之间,镜下可见部分神经元的细胞核固缩或溶解,但结构相对清晰,部分细胞的细胞质中可见尼氏体。见图1、2。

图1 各研究组大鼠脊髓组织HE染色结果(400×)

图2 各研究组大鼠脊髓神经元细胞HE染色结果(5 000×)

2.2 神经行为评分 实验组大鼠各时间点Tarlov评分均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);实验组和对照组大鼠各时间点Tarlov评分均低于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠不同时间点Tarlov评分比较(分,

2.3 炎性因子表达水平 再灌注48 h后,实验组与对照组IL-6、TNF-α表达水平均高于空白组,且实验组IL-6、TNF-α表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠再灌注48 h后IL-6和TNF-α表达水平比较

3 讨 论

脊髓缺血再灌注损伤是脊柱外科手术常见的创伤之一,其损伤机制尚未完全明确[10]。普遍认为脊髓缺血再灌注损伤机制涉及炎性因子与趋化因子表达水平的变化,细胞内外离子水平的变化,脊髓局部脂质过氧化和自由基的产生等[11-12]。

本研究采用外源性CORM2作为CO供应源,具有以下优势。(1)外源性CORM2在溶解于二甲基亚砜后,其羰基被取代并释放CO,且CO释放时间可以持续24 h以上[13-14]。采用外源性CORM2作为CO供应源可确保在较长时间内均有足量的CO供应。(2)粉末状外源性CORM2制剂更易于实现量化控制,更加精确。(3)采用液体制剂静脉注射的方式释放CO,比CO吸入给药具有更高的安全性和可操作性,临床价值也更加显著。此外,与CO吸入给药相比,静脉注射外源性CORM2可以实现长期小剂量给药,不仅避免了使用呼吸机,方便了动物模型的构建,也不会损伤肝脏、肾脏,避免对研究结果造成影响[15]。

本研究以动物模型为基础,分析了外源性CORM2释放的CO在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的保护作用。CO可以通过环磷酸鸟苷(cGMP)途径发挥调节作用。CO进入细胞后,与细胞内可溶性鸟苷酸环化酶的血红素基团中的Fe结合,通过调节离子通道产生多种生物学效应。此外,CO可通过一氧化氮合成酶(NOS)-cGMP途径发挥调节作用,同时降低诱导型NOS(iNOS)和HO-1表达水平,抑制iNOS和HO的破坏作用,间接保护神经细胞。本研究结果显示,在不同再灌注时间点,实验组大鼠Tarlov评分均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且实验组和对照组大鼠在不同再灌注时间点的Tarlov评分均低于空白组,差异有统计学意义(P<0.05);此外,组织病理学检查结果显示,在缺血再灌注48 h后,对照组大鼠脊髓神经元损伤及坏死较为明显,空白组大鼠几乎不发生神经元损伤,而实验组大鼠神经元损伤表现介于对照组和空白组之间。

在缺血再灌注过程中,NOS-cGMP途径发挥了重要的调节作用,包括抑制细胞内NF-κB的表达,降低ICAM-1等黏附因子的表达,减少炎性因子IL-6、TNF-α的释放,以及促进过氧化物的清除,从而减低氧自由基水平等。外界刺激信号可作用于细胞内多种信号转导通路,并最终将信号传导至细胞核内,从而促进IL-6、TNF-α等炎性因子的产生和释放[16]。抑制炎性因子的产生,可降低组织内多形核中性粒细胞的活化水平和聚集能力,避免组织结构和功能损伤,实现组织保护作用。本研究中IL-6和TNF-α检测结果显示,在缺血再灌注48 h后,实验组与对照组IL-6、TNF-α水平均高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05),但实验组IL-6、TNF-α水平均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明外源性CORM2可抑制IL-6、TNF-α的表达。虽然在缺血及再灌注后应用外源性CORM2对组织具有一定的保护作用,但组织损伤已经产生,因此CO的保护作用有所减弱。

综上所述,外源性CORM2可抑制炎性因子的表达,因此对大鼠脊髓缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

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Protective effects of exogenous carbon monoxide releasing molecules 2 in rat with spinal cord ischemia and reperfusion injury*

LIUZhi-gang,XIONGMin△,YUHua-long,ZENGYun

(InstituteofOrthopaedics,AffiliatedDongfengHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To investigate the protective effects of exogenous carbon monoxide releasing molecules 2 (CROM2) in rat with spinal cord ischemia and reperfusion injury.Methods A total of 30 healthy male Wistar rats were divided into experiment group,control group and blank group,with 10 rats in each group.Rats of experiment group were given exogenous CORM2 by intravenous injection 1 h before modeling.Same operation was performed in experiment group and control group to construct rat models.Rats in control group were injected the same dose of saline 1 h after the construction of models.Rat in blank group were given only abdominal operation without any other treatment,and were injected the same dose of saline 1 h after operation.At different time point of operation,evaluation of Tarlov scale,histopathology examination of myeloid tissue,and detection of interleukin-6(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were performed.Results At different time point of reperfusion,Tarlov scores of experiment group were higher than control group,but those of the two groups were lower than blank group (P<0.05).At 48 h after ischemia-reperfusion,damage of neuron in control group was obvious,which was not found in blank group,and the characteristics of neuron damage in experiment group were between control group and blank group.At 48 h after ischemia-reperfusion,levels of IL-6 and TNF-α in experiment group and control group were significantly higher than blank group,while those in experiment group were significantly lower than control group (P<0.05).Conclusion Exogenous CORM2 could be with protective effects of spinal cord ischemia-reperfusion injury,which might be dependent on the inhibition of the releasing of inflammatory cytokines.

exogenous carbon monoxide releasing molecules 2; spinal cord ischemia-reperfusion injury; interleukin-6; tumor necrosis factor-α

湖北省十堰市科技局基金支持项目[十科发(2013)20号]。

刘志刚,男,副主任医师/讲师,硕士,主要从事骨科疾病相关研究。△

,E-mail:xiongm4203@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.009

A

1672-9455(2015)08-1048-03

2014-11-05

2014-12-10)

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