日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆与表达*

雷 黎，刘 淼，沈际佳△

(1.安徽中医药大学第二附属医院检验科,合肥 230061;2.安徽医科大学



·论 著·

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆与表达*

雷 黎1，刘 淼2，沈际佳2△

(1.安徽中医药大学第二附属医院检验科,合肥 230061;2.安徽医科大学

病原生物学教研室,合肥 230032)

目的 获得日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达蛋白。方法 根据GenBank中日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列设计引物，以cDNA为模板聚合酶链反应(PCR)扩增该基因，将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。结果 成功克隆了具有完整开放阅读框的日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂重组质粒，获得相对分子质量约44×103的目的蛋白。结论 成功地克隆表达了丝氨酸蛋白酶抑制剂，为进一步研究该蛋白的特性、功能及免疫保护作用奠定了基础。

日本血吸虫； 丝氨酸蛋白酶抑制剂; 克隆； 表达

在人类寄生虫病中，就社会经济和公共卫生重要性而言，血吸虫病是仅次于疟疾的第二重要的热带病，是一种严重威胁人民健康的人畜共患寄生虫性传染病，在我国仍然是一个重要的公共卫生问题[1]。因而通过免疫方法继续寻找新的血吸虫抗原分子是非常必要的。作者根据GenBank中公布的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的序列设计引物，克隆表达了SPI,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 BL-21大肠埃希菌、表达载体pET28a由本室保存。克隆载体pMD18-T、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、聚合酶链反应(PCR) Marker、蛋白质低分子量的标准品、Tris碱、明胶均购自大连宝生物工程有限公司； 聚合酶链反应(PCR)胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州V-gene生物工程有限公司；其他试剂是国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸虫SPI基因的体外扩增 根据SPI基因序列，设计一对引物，序列为Primer1:5′-GAA TTC ATG GCA CCA AAA GTT CAA G-3′；Primer2:5′-CTC GAG TTA TAA CAT TGG ATT GAT T-3′。两条引物分别引入限制性的内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以日本血吸虫cDNA为模板，PCR反应条件为 94 ℃5 min热启动，94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，1%琼脂糖电泳分析。PCR产物胶回收按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 日本血吸虫SPI基因的克隆与鉴定 将PCR扩增的SPI基因与T载体相连,然后转化XL1-blue；第2天，提取质粒,经XhoⅠ和ECORⅠ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。将表达载体pET28a用同样的两个酶进行酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带,再与已经回收的SPI的PCR产物进行连接，转化BL-21,涂含有卡那霉素的LB平板；第2天，从平板中挑取10个单个菌落，扩大培养，然后提取质粒，用经XhoⅠ和ECORⅠ双酶切鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳。将酶切鉴定正确的克隆送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.3 日本血吸虫SPI的表达 将酶切与测序鉴定正确的克隆，加入到含卡那霉素的3 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min振荡培养过夜；再按1∶50的比例扩大培养约3 h，使OD600为0.6左右时，留取1 mL的菌液；剩余的菌液中加入1 mol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L进行诱导，继续培养，分别在加入IPTG后5 h、12 h收集1 mL的菌液，再将所有收集的菌液均作同样的处理，4 000 r/min离心5 min，每管中加入30 mL的无菌水重悬细菌和30 mL的2×蛋白上样缓冲液，沸水浴中煮沸10 min以裂解细菌，4 000 r/min离心5 min，采用12%凝胶,不连续缓冲系统,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),浓缩胶55 V 1 h、分离胶110 V 1.5 h，考马氏亮蓝染色1 h,摇振脱色过夜，观察结果并拍照。

2 结 果

2.1 日本血吸虫SPI的PCR扩增 PCR扩增后,1%琼脂糖电泳后可以见到约1 200 bp大小的条带,与理论值一致,见图1。

注：1为SPI的PCR产物，M为DNA标记物。

图1 SPI的PCR扩增产物电泳图

2.2 日本血吸虫SPI的重组体的酶切鉴定结果 提取质粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，1%琼脂糖电泳可见大小两条带，可见1 200 bp左右的目的条带出现,与理论大小一致，结果见图2。

注：1为重组体的酶切鉴切，M为DNA标记物。

图2 SPI的酶切鉴定结果

2.3 序列分析结果 将测序结果分别与GenBank进行比对,结果显示本研究克隆入表达载体中的序列为日本血吸虫SPI，表明重组质粒构建成功。

2.4 日本血吸虫SPI的表达(SDS-PAGE) SDS-PAGE结果显示,在没有加入IPTG诱导时,未见明显特异性条带出现,在加入IPTG后的5 h和12 h后,在相对分子质量44×103处可见有明显条带出现，与理论值大小相符(图3)。

注：1为未加IPTG；2为加入IPTG后5 h；3为加入IPTG后12 h,M为蛋白质标准物。

图3 SPI表达的SDS-PAGE图

3 讨 论

日本血吸虫生活史复杂，有性生殖和无性繁殖交替，中间宿主和终末宿主转换[2]，血吸虫在演化过程中虫体内仍具有许多种、属间及各期间高度保守的基因，已知这些高度保守基因序列及其产物在生长、发育、生殖及血吸虫与宿主相互关系中发挥着重要作用，在虫体的信号传递、细胞分化与增殖、蛋白质相互作用和宿主免疫诱导反应等生理生命活动中也是至关重要的。

本实验室在运用对血吸虫感染有抗性的血清免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库时,在25个阳性克隆中，其中就有2个为日本血吸虫SPI[3]。而阎玉涛等[4]用对血吸虫感染存在天然抗性的东方田鼠的血清筛选日本血吸虫成虫cDNA 文库时发现，所筛选出的51个阳性克隆中有10个为含日本血吸虫SPI基因的阳性克隆，可见血吸虫SPI与血吸虫的免疫逃避机制明显相关。

SPI属于丝氨酸蛋白酶超家族，此家族是一类具有共同来源及结构序列高度同源的蛋白酶抑制剂家族[3]。这个家族已发现了数百个成员，广泛分布于动物、植物体和病毒粒子中。SPI具有多种功能，可作为酶的抑制剂起作用，如抑制丝氨酸蛋白酶的活性、抑制纤溶酶原激活剂的活性等。对血吸虫SPI的功能研究较少,Lim 等[5]发现，小鼠先注射非肽类SPI，然后进行尾蚴攻击感染，可使小鼠获得80%的减虫率和92%的减卵率。很多学者认为，血吸虫本身SPI的作用在于该抑制剂与血吸虫的丝氨酸蛋白酶共价结合后，封闭了丝氨酸蛋白酶的表位，该复合物中丝氨酸蛋白酶的免疫原性消失；同时该抑制剂可抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白从而抑制嗜中性粒细胞对寄生于体内血吸虫的攻击。

本研究以日本血吸虫cDNA为模板，选择不含任何多克隆酶切位点的T载体，当PCR产物在与T载体相连后，转化细菌,提取质粒,然后使用PCR引物中引入的限制性内切酶将PCR产物酶切下来,不仅极大地提高了PCR产物酶切效率，而且克服了直接酶切,胶回收PCR产物引起的损失,大大提高了PCR产物与相应载体的连接效率，并将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，IPTG诱导表达重组蛋白——SPI。SPI是一类从病毒到人类均有分布的蛋白，相对分子质量较大，通常由300～500个氨基酸残基组成。它含有8～9个α-螺旋、3个β-折叠组成的保守三级结构，功能域位于C端，有一个暴露于蛋白主体外的反应中心环(RCL)，其与抑制蛋白酶的种类和活性密切相关。其中，RCL上的P1位点氨基酸残基决定了抑制蛋白酶的特异性，SPI可在细胞内也可分泌到细胞外发挥作用，它主要参与寄生虫与宿主的相互作用，可作用于宿主酶利于虫体获取营养，或抵抗宿主酶对虫体的损伤，或参与调控宿主的炎症及免疫应答[6]。重组表达获得血吸虫SPI，为进一步研究日本血吸虫SPI的特性、功能及免疫保护作用，深入了解血吸虫适应宿主体及对宿主致病的分子机制，发展基于抑制剂靶点干预的血吸虫病防治药物提供参考,也为寻找血吸虫新保护性候选疫苗分子的研究提供了新思路。

[1]袁忠英,沈玉娟,曹建平.等.东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库及新基因分析[J].中国血吸虫病防治杂志,2008,20(4)：255-259.

[2]杨燕萍,郭素霞,陈晶,等.编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定[J].中国人兽共患病学报,2010，26(9):830-834. [3]任翠平,王晓楠,雷黎,等.血吸虫感染抗性人血清筛选日本血吸虫童虫eDNA文库[J].中国地方病学杂志,2007,26(5)：490-493.

[4]阎玉涛,刘述先,宋光承,等.东方田鼠天然抗体相关的日本血吸虫抗原基因筛选和克隆[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2001,19(3)：153-156.

[5]Lim KC,Sun E,Bahgat M,et al． Block-age of skin invasion by schistosome cercariae by serine protease inhibitors [J]．Am J Trop Med Hyg,1999,60(3):487-492．

[6]李晖,彭礼飞.寄生线虫丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展[J].国际医学寄生虫病杂志,2011,39(6):344-349.

Cloning and expressing of Schistosoma japonicums serine protease inhibitor*

LEILi1,LIUMiao2,SHENJi-jia2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei,Anhui230061,China;2.ResearchandTeachingSectionofPathogenicBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230032,China)

Objective To obtain Schistosoma japonicums serine protease inhibitor(SPI) prokaryotic express protein.Methods The primer was designed on the basis of sequence of Schistosoma japonicum SPI in Genbank,the PCR method was used to amplify the gene with cDNA as the template.Then the product was subcloned into prokaryotic expression vector pET28a,IPTG induced to express the recombination protein.Results The Schistosoma japonicums SPI recombinant plasmid with complete patency reading frame was successfully cloned and the interest protein with the relative molecular mass 44×103was obtained.Conclusion SPI is successfully cloned and expressed,which lays the foundation for the further study of the protein′s character,function and immunoprotection effect.

Schistosoma japonicum; serine protease inhibitor; clone; express

安徽省自然科学基金项目(050430805)。

雷黎，男，副主任技师，硕士研究生，日本血吸虫分子免疫学，主要从事临床分子免疫学工作。

△通讯作者，E-mail：shenjijia@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.004

A

1672-9455(2015)02-0151-02

2014-05-22

2014-11-06)