手性修饰氧化石墨衍生物对小鼠成神经瘤细胞活性的影响*

杨景霏，廖进齐，陈 敏，蔡小康，李仲娟△

(1.湖北省武钢三中，湖北武汉 430080；2.湖北理工学院，湖北黄石 435003)



·论 著·

手性修饰氧化石墨衍生物对小鼠成神经瘤细胞活性的影响*

杨景霏1，廖进齐2，陈 敏2，蔡小康2，李仲娟2△

(1.湖北省武钢三中，湖北武汉 430080；2.湖北理工学院，湖北黄石 435003)

目的 比较手性修饰的氧化石墨(GO)衍生物对小鼠成神经瘤细胞N2a活性的影响。方法 倒置荧光显微镜观察N2a细胞形态，MTT法检测N2a 细胞的活性。结果 在0.1～0.4 μmol/L浓度GO衍生物对N2a 细胞活性影响呈浓度相关，其中0.4 μmol/L的GO衍生物对N2a 细胞生长状况最好；L-型GO(L-GO)和D-型GO(D-GO)促N2a 细胞增殖率分别为94%和52%，二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论 手性修饰的GO衍生物在0.1～0.4 μmol/L能促进N2a 细胞生长，L-GO促进N2a 细胞生长活性比D-GO强。

氧化石墨； 小鼠成神经瘤细胞； 细胞活性

氧化石墨(graphite oxide,GO)是石墨经氧化而成的新型纳米级材料，人们很早就预测石墨烯在生物医药领域将会有广泛的应用前景[1-2]，GO经超声处理后得到GO溶液，GO通过L(D)-半胱氨酸的还原可以得到不同手性衍生物[3]。本实验通过L-GO和D-GO对N2a 细胞生长状况的考察，探讨其在医药应用中可能存在的差异性。

1 材料与仪器

1.1 材料 手性修饰的GO衍生物由武汉理工大学分子材料实验室友情提供。小鼠成神经瘤细胞N2a购自武汉细胞保存中心，Hanks液、台盼蓝、胎牛血清和 PRMI-1640培养粉购自Gibco公司，MTT购自上海博谷生物科技有限公司。培养瓶、胰蛋白酶、培养板和细胞培养用的吸头购自美国Costar公司。二甲基亚砜(dimethyl-sulfoxide，DMSO) 购自Sigma公司。

1.2 仪器 苏州净化二级生物安全柜BHC-1300ⅡB2，美国ThermoFisher贺利氏CO2培养箱，美国伯乐DNM-9602型酶标仪，日本Olympus CKX41倒置生物显微镜及Olympus 1X74倒置荧光显微镜。

1.3 方法

1.3.1 小鼠成神经瘤细胞N2a的培养[4]N2a以按105个细胞/瓶用DMEM-F12培养液置37 ℃ 5% CO2培养箱中进行贴壁培养(培养液含10%胎牛血清、双抗100 U/mL青霉素以及100 μg/mL硫酸链霉素)，每3天用胰酶消化收集细胞洗涤后更换培养液，取对数期细胞进行实验。

1.3.2 MTT法检测细胞活性[5]在96孔培养板中，按104个细胞/孔进行培养，24 h后于不同孔内分别加入0.1～0.4 μmol/L浓度L-GO或D-GO液，培养72 h后加20 μL MTT溶液继续培养4 h，再加入150 μL二甲基亚砜(DMSO) 振荡10 min，490 nm处测吸光度(OD) 值。

1.4 统计学处理 采用 Excel分析软件，用t检验对各组数据进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠成神经瘤细胞的观察 对数期N2a细胞经胰蛋白酶消化后用2%胎牛血清Hanks液洗涤，台盼蓝计数活细胞，按2×104/L的细胞浓度分别加入L-GO和D-GO刺激物在6孔培养板培养3 d，以没有刺激细胞培养孔为空白对照。倒置荧光显微镜观察，无刺激物的对照组细胞呈梭形，圆形或多角生长，培养孔中无漂浮死细胞；L-GO刺激后的细胞呈梭形或多角形蔓延生长，可见极少的漂浮细胞；D-GO刺激后的细胞蔓延生长，细胞老化程度较高，可见部分细胞边界不清，如图1。

2.2 不同浓度GO衍生物对N2a细胞生长活性的影响 对数期N2a细胞按2×105/L浓度接种于96孔培养板，分别加入L-GO和D-GO刺激培养3 d，用酶标仪检测各孔的吸光度，按刺激物浓度作图，图2显示0.1～0.4 μmol/L刺激物对N2a细胞呈浓度依赖，刺激物浓度在0.4 μmol/L最好，L-GO对N2a细胞的活性高于D-GO，各浓度比对差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 显微镜观察N2a细胞生长活性

图2 GO衍生物对N2a细胞生长活性比较

2.3 0.4 μmol/L GO衍生物对N2a细胞增殖比较 图3结果显示，L-GO对N2a细胞的活性为94%，D-GO对N2a 细胞的活性为52%，两者间统计学分析差异有统计学意义(P<0.01)。

图3 0.4 μmol/L GO衍生物对N2a细胞生长活性的比较

3 讨 论

GO衍生物是单原子结构，表面有很多的含氧活性基团，生物相容性很好，而且十分有利于对GO的表面进行化学功能化修饰。由于氧化石墨烯表面含有羟基、环氧基、羧基等基团，这些基团成为氧化石墨烯发挥功能的活性中心[6]。氧化石墨烯在生物医学方面的应用发展十分迅速。最近几年，氧化石墨烯在疾病诊断方面，微生物学方向，药物的运输以及分子生物学等方面得到了各研究学者的广泛关注[7]，国外也有学者将其作为药物载体开发[8-9]。最近在阿尔茨海默病(AD)研究中，由于GO衍生物能透过血脑屏障，对神经瘤模型细胞具有活性[10]，因此，GO衍生物也作为靶向药物正在被研究[11]。本实验以N2a 细胞为模型，分别考察L-GO和 D-GO诱导下该细胞的生长活性。结果显示，0.1～0.4 μmol/L GO衍生物对N2a 细胞的活性呈浓度依存，L-GO对N2a 细胞的生长更有促进作用，两者之间的活性差异有统计学意义(P<0.01)。L-GO和D-GO的这种差异性，为GO衍生物作为靶向药物的进一步开发提供了科学依据。

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Influence of chirally modified graphite oxide derivatives on activity of mouse neuroblastoma cells N2a*

YANGJing-fei1,LIAOJin-qi2,CHENMin2,CAIXiao-kang2,LIZhong-juan2△

(1.No.3HighSchoolofWuhanIronandSteelCorporation,Wuhan,Hubei430080,China;2.HubeiPolytechnicUniversity,Huangshi,Hubei435003,China)

Objective To compare the influence of chirally modified graphite oxide (GO) derivatives on the activity of mouse neuroblastoma N2a cells.Methods The morphological change of N2a cells was observed by the inversion fluorescence microscope and the activity of N2a cells was measured by the MTT method.Results The influence of GO derivatives in the concentration range of 0.1-0.4 μmol/L on the activity of N2a cells showed the concentration correlation,in which the GO derivatives with the concentration of 0.4μmol/L was best for the growth status of the N2a cells;the promoting N2a cells proliferation rates of the L-type GO and D-type GO were 94% and 52% respectively,the difference between them revealed the statistical significance(P<0.01).Conclusion The chirally modified GO derivatives in the concentration range of 0.1-0.4 μmol/L could promote N2a cell growth,and the activity of L-GO promoting N2a cell growth is stronger than that of D-GO.

graphite oxide； mouse neuroblastoma N2a cells； cellular activity

教育部留学生启动资金(46-1)；湖北理工学院创新团队项目组(201025)。

杨景霏，女，在校学生，研究方向为细胞生物学。△

，E-mail:1525677891@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.005

A

1672-9455(2015)02-0153-02

2014-05-09

2014-11-04)