制备全人源抗体的新方法研究进展

蒋一苇，谭树华

(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京211198)

抗体(Antibody)，亦称免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，是一种由B淋巴细胞产生的糖蛋白分子，可以特异性地结合抗原。抗体的基本结构包括2个相同的重链和2个相同的轻链。N-端为重链可变区(Variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(Variable region of light chain，VL)，负责结合抗原;C-端为恒定区，重链的恒定区可以与免疫系统的其他分子相互作用以发挥相应的效应［1］。

抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂，已有超过100年的发展历史。随着抗体技术的发展，制备抗体的方法已由多克隆抗体技术和单克隆抗体技术，发展为基因工程抗体技术。其中，基因工程抗体以其对人体毒副作用小、人源化和高度特异性，越来越显示其优势［2］。近些年，在基因工程抗体的研究中越来越多的研究者通过从人B细胞中直接获取抗体的方法，获得了全人源的单克隆抗体。由于这些抗体是在人体内自然产生的，它们的安全性、有效性和与人类疾病的相关性都比传统的鼠源抗体有了明显的提升。这些全人源抗体作为一种靶向治疗有很好的应用前景。例如，过去人们认为，只有极少的抗体能对抗一系列不停进化的病毒，如流感病毒和人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)，并且这种抗体极难分离。然而，以优化的筛选过程和精挑细选的感染者作为抗体来源，研究者采用高通量技术已成功分离和鉴定了几种这样的抗体。此成果在抗体介导的治疗和疫苗设计中有很好的应用［3］。

总体来看，通常直接从B细胞中获得这种全人源的单克隆抗体的方法有3种:①从人源的噬菌体抗体库中筛选;②使B细胞永生化，然后进行体外筛选;③细胞分选后，进行克隆和表达免疫球蛋白基因［3］。笔者对制备全人源抗体的新方法进行了综述。

1 噬菌体抗体库

1．1 噬菌体抗体库的基本原理和发展历程 噬菌体展示技术(Phage display)是构建抗体库的常用方法。该技术的基本原理是:将抗体片段的基因克隆到噬菌体基因中，与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体表面。噬菌体把抗体的基因型和表现型融为一体，每个噬菌体颗粒“展示”一种抗体，这些重组噬菌体的集合称为一个噬菌体抗体库。这种“展示”抗体的噬菌体既能识别相应抗原并与其结合，又能感染宿主菌以进行再扩增，利用抗原抗体特异性结合进行筛选、富集和扩增，从而得到所需的抗体片段［4-7］。

噬菌体展示是一门发展迅速的技术。20世纪80年代中期，George Smith就在M13噬菌体表面表达了一段外源蛋白的片段［8］，开创了噬菌体展示的先河。1991年剑桥大学James D Marks［4］等系统讲述了构建单链抗体库的过程，从人血中分离出外周血淋巴细胞，提取出总RNA，以RNA为模版逆转录为cDNA。通过对抗体的保守序列进行分析，分别设计出了扩增重链(VH)、轻链(VL)的引物。以逆转录得到的cDNA为模版，通过PCR技术扩增到抗体重链、轻链的基因，再通过重叠延伸PCR(Overlap PCR)使重链和轻链以1个45 bp大小的连接物(Linker)随机相连，形成只有抗体可变区序列的单链抗体。克隆单链抗体基因，以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，得到库容大于107的单链抗体库。

此后，很多研究者在此研究的基础上，对单链抗体库的构建进行了改进。由于在一般情况下筛选出抗体的亲和力与库容的大小成正比，研究者开始尝试构建库容更大的抗体库［9-11］。1996 年 Tristan J Vaughan［9］等分别构建了 VH 和VL库，然后组装成scFv库，库容高达1．4×1010。1998年Michael D Sheets等［10］也分别构建了VH和VL库，但是对组装成scFv的步骤进行了优化，研究者选择在VH基因的5’端和VL基因的3’端延伸了大概200个碱基对(Base pair，bp)的位置设计引物，由此得到延长的VH和VL，从而组装成的scFv两端也会有延长的序列，延长的序列不仅保证了酶切位点两端保护碱基足够的长度，提高了酶切效率，还有利于鉴定scFv是否正确组装。最终研究者得到库容为6．7×109的单链抗体库，并筛选出更高亲和力的抗体。2000年Daniele Sblattero等［11］采用了Cre催化重组的方法，进一步提高了库容。首先，研究者构建了一个相对小的初级抗体库(库容为7×107)，其中VH和VL基因被2个非同源的lox位点分开;然后，通过噬菌粒感染能表达Cre的宿主菌，使VH和VL基因重组。采用该方法构建的抗体库，库容高达3×1011。

1．2 噬菌体抗体库的特点 噬菌体展示技术的最大特点是能够将表达的目的蛋白与其基因序列相对应，并且其本身具有的可选择性和可扩增性，已成为一种非常高效的表达、筛选和扩增抗体的体系。该技术绕过了免疫动物的方式制备抗体，能够避免鼠源性抗体诱发的不良免疫反应［4］。此外，这种体外筛选的方法可以克服免疫耐受，能筛选出高亲和力的抗体来结合高度保守的靶点，如泛素和组蛋白等［12］。

然而，噬菌体抗体库的限制也很明显，由于建库所使用的是原核表达系统，该系统糖基化过程的缺失和一定程度上的大分子空间结构的错误折叠，可能会导致抗体失去应有的功能［13］。因此，在筛选结构功能复杂的抗体时筛选后的后期修饰和表达优化是非常必要。

1．3 噬菌体抗体库的应用现状 自从20多年前抗体库技术的出现，已经有许多抗体通过体外抗体库筛选的方法被发现并得到应用(表1)，其中有些抗体有很突出的性质和功能，甚至从未用免疫动物的方法得到［12］。随着分子克隆和高通量筛选等技术的进一步发展，抗体库技术会在未来将具有更加广阔的发展空间。

表1 一些从抗体库中筛选得到的抗体

2 B细胞永生化

采用杂交瘤技术，鼠源B细胞可以永生化，但是人B细胞难以通过这种方式永生化［3］。然而，另一种方法的出现使人B细胞永生化变为现实。1977年，研究者采用Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)介导的转化使人记忆B细胞永生化［22］，但是该方法的低效率令研究者难以获得大量的抗原特异性B细胞。直到2004年，研究者在EBV感染前和感染过程中，通过用Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)的激动剂CpG DNA或其他多克隆激动剂来激活B细胞，使转化效率有了大幅提升［23］。这种提高EBV转化率的试验方案目前已被广泛用于制备单克隆抗体。

典型的人B细胞永生化过程包括分离和培养外周血淋巴细胞或分选出来的IgG+记忆B细胞，感染EBV，并加入TLR9的配体和/或经照射的异基因单核细胞来提供共刺激信号。在此条件下，B细胞增殖并分泌抗体。7～14 d以后，在培养细胞的上清中检测抗原结合和/或病毒中和。产生目的抗体的B细胞经过克隆后进行进一步筛选，得到在单细胞水平有最优活性的B细胞，然后进行免疫球蛋白基因的克隆和测序［23］。

由于记忆B细胞的永生化和高通量筛选抗原特异性B细胞技术的出现，使得研究者可以筛选稀有的B细胞，即使接触抗原在很久以前发生，也可以筛选得到其抗体。例如，研究者从年长者的血液中分离并永生化了几十年前形成的记忆B细胞，从而筛选出了针对早已不流行的流感病毒抗体［24］。采用B细胞永生化方法制备单克隆抗体的问题主要在于:该方法需要筛选大量的B细胞才能获得所需的特异性抗体，一般情况下，培养和筛选超过10 000的记忆B细胞才能获得不到10个特异性的B细胞［3］。

3 单细胞克隆表达

单细胞逆转录PCR的应用极大地促进了人源单克隆抗体的发展，采用该技术可以从流式细胞仪分选得到的一种B细胞中分离同源免疫球蛋白的重链和轻链可变区基因。随后，将这些基因克隆到真核细胞中进行表达。这种方法的优点是，无论特异性的B细胞多么稀有，只要能被流式细胞仪所识别，这种方法就能筛选到单克隆抗体［3］。

采用荧光标记的抗原来“诱捕”抗原特异性的B细胞是流式细胞仪分选的常用方法。研究者采用HIV-1表面的刺突蛋白作为探针，已经成功从患者的IgG+记忆B细胞中分离到HIV特异性的人源单克隆抗体［25］。使用流式细胞仪检测抗原特异性的单克隆抗体主要受限于以下因素:首先，只有细胞表面表达免疫球蛋白的B细胞类型才能检测得到;其次，需要有高度特异性并且非常稳定的抗原作为探针［3］。

4 小结与展望

噬菌体抗体库、B细胞永生化和单细胞克隆表达是3种目前常用的从B细胞中获得全人源单克隆抗体的方法。对于方法的选择，除了研究者的专长外，还需要考虑制备抗体的用途和关于特定疾病B细胞免疫的已有报道，如特定的B细胞是否稀有、B细胞表面分子的表达量、结合表位的选择等，这些细节往往是试验成败的关键。

随着研究者使用各种方法获得越来越多的全人源单克隆抗体，它在安全性、有效性和与人类疾病的相关性方面体现出了巨大优势。研究者所面临的一大挑战是提高抗体作用的“宽度”。在某些个体中分离出来的单克隆抗体不一定在所有个体中都能起作用［3］。因此，研究者需要追踪更广泛的B细胞来源，进行更深层次的抗体突变和亲和力成熟，才能得到作用更广泛的治疗性单克隆抗体。相信随着抗体技术的不断成熟和基础研究的不断深入，全人源单克隆抗体在生命科学和医学中的应用将会更加广泛。

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