呼吸道九联检试剂在儿童呼吸道感染病原体检测中的临床意义探讨

王洪建

(濮阳市人民医院血液病研究所 河南濮阳 457000)

儿童呼吸道病毒感染是儿科患者中最常见的疾病，发病急、感染重，儿童多不能自述。为指导临床合理用药，需要一种快速简便准确的试验方法进行诊断［1］。本次研究针对以上特点，希望找到一种临床可快速诊断的简易方法，更好服务于患者与临床。

1 对象与方法

1．1 研究对象 选取2014年1月至2014年7月在濮阳市人民医院儿科病区住院的1 516例呼吸道感染儿童患者，其中男性682例，女性834例，年龄3个月～13岁，平均(2.5±0.3)岁。

1．2 检测试剂 九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂为西班牙VIRCELL公司进口产品，购自郑州安图生物科技有限公司。

1．3 检测方法

1．3．1 标本处理 采集患者空腹静脉血2.0 ml，分别取15μl血清和15μl PBS液加入1.5 ml塑料安瓿管中，震荡充分混匀。用抗人球蛋白IgG吸附剂150μl加入30μl混合液中，彻底混匀，处理后的血清3 000 r/min离心15 min，除去沉淀。

1．3．2 操作过程 在载玻片的九孔中每孔加15μl吸附剂处理过的血清标本。在1个载玻片加入15μl阳性对照，另1个加15μl阴性对照。将载玻片放湿盒37℃温育1 h以上。用PBS洗液缓慢来回冲洗3次以上，避免直接对标本孔冲洗，然后浸泡在足量PBS液中放置摇床轻摇10 min。取出用蒸馏水缓慢水流冲洗。载玻片自然风干后每孔加入15μl FITC结合物溶液，将载玻片放入湿盒，37℃温育30 min。取出载玻片，用PBS洗液缓慢流水冲洗，然后浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10 min，自然风干，加适量封片介质，小心盖上载玻片。最后用荧光显微镜(日本OLYMPUS公司的CX22荧光显微镜)在400倍放大率下观察结果。

1．3．3 结果判断 阳性结果:可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒的整个包被孔中有3%～15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光(在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞);军团菌、衣原体或立克次体中所有的菌体呈现出苹果绿色荧光;支原体出现细胞外围苹果绿色荧光。阴性结果:可观察到军团菌、肺炎支原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。

1．3．4 注意事项 严格按照实验操作说明书操作，PBS洗液需要事先配置，摇匀直至充分溶解，配好后储存2～8℃备用，2 d内用完，有沉淀弃去重配。观察结果要快速，需要有专人审核复检，以免误判误认，结合操作手册，建立本实验室的判断标准。

2 结果

2．1 各种病原体阳性感染率 在1 516例儿童呼吸道感染患者中，总阳性率为35.5%(537/1 516)。各种病原体中阳性率最高为肺炎支原体，占21.2%(321/1 516)，其次为腺病毒6.5%(99/1 516)，呼吸道合胞病毒 4.5%(68/1 516)，副流感病毒 3.3%(50/1 516)。

2．2 混合感染 片中可见2种以上病毒混合感染，多为肺炎支原体合并乙型流感病毒及肺炎支原体合并副流感病毒。混合感染率可达12.8%(194/1 516)，在阳性病例中占36.1%(194/537)。

3 讨论

儿童呼吸道感染属于儿科常见多发疾病，由于儿童年龄小，免疫力相对低下，起病急，尤其1岁以下儿童不能自述体征，往往伴随高热、抽搐症状，有一定病死率，严重威胁儿童健康。本调查结果中，肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒是濮阳地区急性呼吸道感染的主要病毒病原体，并且有相当数量的患儿合并2种病毒混合感染，然而不同地区、不同人群可能是不同的。随着近几年病毒学的发展，国内认为各种病毒的总发病数有增多趋势。因此，明确病原体是有效治疗小儿肺炎的首要问题，但小儿肺炎的病原谱非常复杂。国外对小儿肺炎的病原体及临床流行病学的研究资料较多，发达国家主要以病毒为主，其中以呼吸道合胞病毒占首位，细菌性肺炎以肺炎链球菌为主。我国对小儿肺炎病原学做系统研究较少，小儿肺炎在临床上表现轻重不一。因此，病原学检查非常重要，有利于早期诊断。研究显示，泸州地区以呼吸道合胞病毒为主［2］。濮阳市人民医院收治病例以肺炎支原体感染为主，呼吸道合胞为第3位，与各地报道的呼吸道病毒检出率不尽相同，所以各地检验工作者应探索建立本地呼吸道病毒流行谱，熟悉当地儿童呼吸道疾病流行状态［3］。

本次九项呼吸道病原体检测均为IgM，儿童呼吸道感染后首先出现IgM抗体，通常认为在病毒感染1周后出现，7～14 d达到高峰，表明有近期感染，在血清持续时间较短，一般为1～3个月，因此IgM是近期感染的有效标志物。采用间接免疫荧光法检测呼吸道病毒特异性IgM，可以提供呼吸道病毒感染血清学证据，分析呼吸道病毒的流行病学特点，帮助指导临床合理用药［4］。本研究从抽取患者静脉血到得出检查结果共需要大约3 h，时间短，出结果较快，基本能够为临床提供比较及时的检验结果，满足了临床需求。

濮阳市人民医院儿科为医院重点学科，儿科普通病区与儿科重症监护室开放床位400余张，每年冬春季床位仍供不应求，临床对儿童呼吸道病毒的快速检测有迫切要求，细菌培养虽然为细菌感染诊断金标准，但其有需数十小时培养的基本需求，无法满足儿科临床快速诊断、快速治疗的要求。如无病原学诊断结果，盲目用药，容易造成误诊、误治和滥用抗生素现象。近年来由于免疫技术的发展，如直接、间接免疫荧光法等标记技术，特别是九联检试剂，检测方便快速，符合临床要求，使病原学快速诊断成为可能，在临床诊断上有重要意义［5－6］。

九联检试剂虽然可以同时检测九项病毒，但是儿童呼吸道感染病毒并不能全部检测，还需要多种检验技术的配合应用，才能作出更加合理的诊断，并且该试验必须同时检测九种病毒，医生不能面对患者症状分析并单独开具某种病毒检测，客观上相对增加了患者的负担，需要在这方面适当改进，使这种试剂技术更好地服务于临床，服务于患者。

［1］ 秦茵茵，吴国锋，秦笙，等．九项呼吸道联检试剂对多种呼吸道感染病原体检测的临床意义［J］．中华生物医学工程杂志，2012，18(2):124－127．

［2］ 刘春艳，李程．2011年泸州地区小儿肺炎感染病原学调查［J］．中国医药导报，2013，10(9):97 －99．

［3］ 董玉琳．呼吸道病原体九联检在小儿急性呼吸道疾病中的应用［J］．中外医疗，2012，31(33):170，172．

［4］ 王加芬，王凤秀，郑媛媛，等．呼吸道病毒特异性IgM检测对儿童呼吸道感染的指导意义［J］．中国免疫学杂志，2015，(2):257 －260．

［5］ Ray CG，Minnich L L．Efficiency of immunofluorescence for rapid detection of Common respiratory viryses［J］．JClin Microbiol，1987，25:355－357．

［6］ 黄秋琳，许翔，江淑芳，等．直接免疫荧光法对多种呼吸道病毒检测的临床意义［J］．检验医学与临床，2008，5(3):135 －136．