标本放置时间对PL-11检测血小板功能的影响

朱 远，关 杰，田月强，李 莉，平牧野，任军伟，邓新立，丛玉隆

1解放军总医院 南楼检验科，北京 100853；2北京大学第一医院 检验科，北京 100034；3兵器工业北京北方医院 检验科，北京 100089

标本放置时间对PL-11检测血小板功能的影响

朱 远1，关 杰2，田月强1，李 莉1，平牧野1，任军伟3，邓新立1，丛玉隆1

1解放军总医院 南楼检验科，北京 100853；2北京大学第一医院 检验科，北京 100034；3兵器工业北京北方医院 检验科，北京 100089

目的探讨标本在室温保存时，不同放置时间对血小板功能检测仪PL-11结果的影响。方法采集我院2012级学员队20位健康学员及2013年我院门诊20位服用氯吡格雷和阿司匹林的冠心病患者肘静脉枸橼酸钠抗凝全血，应用PL-11分别在采血后不同保存时间点(2 h、4 h、8 h)测定不同血小板活化诱导剂诱导的血小板聚集率。结果健康组：以花生四烯酸(arachidonic acid，AA)为血小板活化诱导剂时，2 h、4 h、8 h的放置时间对血小板聚集功能未产生影响(P＞0.05)；二磷酸腺苷(adenosine di-phosphate，ADP)为诱导剂时，血小板聚集率在4 h明显降低(P＜0.01)，8 h时已经降低至4.3%(P＜0.01)；胶原(collagen，Col)诱导的血小板聚集率在采血后4 h时较2 h明显降低(P＜0.01)，但与8 h差异无统计学意义(P＞0.05)。服用抗血小板药物组：AA诱导的血小板聚集率2 h、4 h、8 h两两差异均无统计学意义(P＞0.05)，ADP诱导的血小板聚集率在4 h时明显降低(P＜0.01)，4 h与8 h差异无统计学意义(P＞0.05)，Col诱导的血小板聚集率在8 h后出现明显降低(P＜0.01)。结论枸橼酸盐抗凝血标本采集后放置时间对PL-11血小板功能检测存在影响，在检测健康人组或已服用双联抗血小板药物患者组时，AA诱导血小板聚集受时间影响较小，ADP与胶原诱导血小板聚集时随着标本放置时间延长，血小板聚集率降低。结合凝血功能检测对枸橼酸盐抗凝血的要求，PL-11检测血小板功能时，AA诱导聚集可在采血后4 h内完成，ADP与胶原诱导应在采血后2 h内完成。

血小板聚集功能；质量控制；PL-11；放置时间

冠心病患者在服用抗血小板药物治疗时，实验室可以进行血小板功能检测以监测抗血小板治疗。血小板功能检测仪PL-11是一种通过库尔特原理连续计数活化前后血小板数来评估血小板功能的检测方法。目前已有研究认为该方法可监测抗血小板治疗[1-2]，但尚无对该方法质量控制方面的报道。本研究通过分析不同标本放置时间对PL-11检测血小板功能的影响，为PL-11血小板功能分析质量控制提供试验依据。

资料和方法

1 对象 征集我院2012级学员队男学员20名，平均年龄(28.6±6.1)岁，平均血小板数(215.7± 58.8)×109/L。另选择2013年我院心内科门诊确诊为冠心病并同时服用阿司匹林及氯吡格雷的男性患者20例，平均年龄(62.4±13.9)岁，平均血小板数(217.4±71.0)×109/L。

2 仪器与试剂 南京英诺华医疗科技有限公司的PL-11血小板功能分析仪及配套花生四烯酸试剂(arachidonic acid，AA)(浓度2 g/L)，二磷酸腺苷试剂(adenosine di-phosphate，ADP)(1 mmol/L)，胶原试剂(collagen，Col)(2 mg/ml)；真空采血管为3.2%枸橼酸盐抗凝管，购自美国B.D公司；1 ml移液枪，200μl移液枪。

3 标本采集与检测 采集每位受试者3管枸橼酸盐抗凝全血，置于室温保存，分别在采血后2 h、4 h、8 h使用PL-11对标本进行测试。吸取0.5 ml枸橼酸盐抗凝全血至PL-11检测试管开始检测。PL-11在计数血小板基础值后，自动加入一种血小板活化诱导剂(ADP 40μl最终浓度：4 mmol/L；AA 25μl最终浓度：0.3 mmol/L；Col 40μl，最终浓度：0.16 mg/L)，间隔一定混匀时间后连续进行血小板计数，得到最低血小板计数值，结果以最大血小板聚集率表示。

4 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。检测数据以表示，多组数据间比较使用ONE-WAY ANOVA方差分析方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

两组血小板聚集率，健康对照组由AA诱导的PL-11最大血小板聚集率(%)分别为82.7%±7.2% (2 h)、82.8%±7.5%(4 h)、75.8%±14.6%(8 h)，不同放置时间最大血小板聚集率差异无统计学意义(P＞0.05)；由ADP诱导的最大血小板聚集率(%)分别为70.6%±7.8%(2 h)、58.8%±9.8%(4 h)、4.3%±0.4%(8 h)，各时间点间差异有统计学意义(P＜0.01)；由Col诱导的最大血小板聚集率(%)分别为75.1%±7.9%(2 h)、50.1%±16.1%(4 h)、45.1%± 14.4%(8 h)，2 h与4 h，2 h与8h间差异有统计学意义(P＜0.01)。抗血小板药物组，由AA诱导的PL-11最大血小板聚集率(%)分别为30.1%±11.0% (2 h)、27.3%±8.9%(4 h)、26.3%±7.9%(8 h)，不同时间差异无统计学意义(P＞0.05)；由ADP诱导的最大血小板聚集率(%)分别为48.2%±10.9%(2 h)、34.8%±12.1%(4 h)、28.5%±6.5%(8 h)，2 h与4 h，2 h与8 h间差异有统计学意义(P＜0.01)；由Col诱导的最大血小板聚集率(%)分别为41.3%±15.2% (2 h)、35.3%±10.5%(4 h)、30.5%±7.1%(8 h)，仅2 h与8 h间差异有统计学意义(P＜0.01)。见图1。

图 1 放置时间对血小板聚集率的影响Fig. 1 Effects of storage time on platelet aggregation A: healthy group; B: treatment group,aP＜0.01

讨 论

20世纪初，Duke[3]首次利用出血时间间接检评估小板功能。后来的研究认识到在病理状态下，活化的血小板和内皮细胞之间相互作用[4]，血流切变力增高(＞5 000/s)等因素，均可直接活化血小板，引起该部位血小板活化诱导剂的形成与释放，包括花生四烯酸经环氧化酶(COX)作用形成的血栓烷A2(TxA2)、二磷酸腺苷和胶原等，最终形成血栓。因此检测血小板功能成为了解血栓风险和监测抗血小板治疗的一种方法。PL-11是一种通过计数血小板活化前后数量来判断血小板聚集功能的检测方法。目前已有文献报道该方法与经典光比浊法在监测抗血小板治疗时具有较好相关性及重复性[1-2,5-6]，但PL-11的检测前质量控制如标本放置时间、放置温度、试剂浓度等对检测结果的影响尚未有报道。本文主要研究样本在检测前放置时间对PL-11的影响。

光比浊法检测血小板功能应在室温进行，检测时间最好为采血后30 min ～ 2 h，不能超过4 h[7-8]。因此我们研究了在2 h、4 h、8 h时PL-11检测血小板聚集功能的差异。结果发现，当AA为血小板活化诱导剂时，血标本放置2 h、4 h、8 h后血小板聚集率无明显差异，因此对于AA为诱导剂的血小板功能检测时血液标本保存可在4 h内检测。当以ADP为诱导剂时，我们发现血小板聚集率在4 h明显降低，8 h时已经降低至4.3%。这可能与低浓度ADP刺激血小板聚集后易发生解聚有关。因此当以ADP为诱导剂时，PL-11检测血小板聚集率应在2 h内完成检测。我们发现胶原诱导的血小板聚集率在采血后4 h时较2 h时明显降低，胶原为诱导剂的检测也应于2 h内完成。这与之前关于标本放置时间对光比浊法的影响研究是一致的[9]。

本研究结果发现，PL-11在2 h时测健康组血小板聚集率高于治疗患者组，证实阿司匹林与氯吡格雷对患者血小板功能抑制的实验室监测有效性。服药患者组中，AA诱导的血小板聚集率在2 h、4 h、8 h均无明显差异，Col诱导的血小板聚集率在8 h时出现明显降低，结果与健康组相似。ADP诱导的血小板聚集率在4 h时明显降低，这与之前文献有相似的结果[10]，该研究中以ADP为诱导剂，标本放置3 h时较采血后立即检测降低近50%。我们的研究还发现，ADP为诱导剂时，4 h与8 h无明显差异，且8 h时血小板聚集率明显高于健康人组，可能是由于冠心病患者存在高血小板聚集率，即高血小板活化状态下，尽管其已服用氯吡格雷抑制P2Y12受体，但在标本放置时间较长时仍有较正常人高的血小板聚集率。因此，该结果提示放置时间对服用抗血小板药物患者检测结果有影响，且似乎与健康人不同，可进一步验证标本放置时间对服用抗血小板药物状态下健康人与冠心病患者的差异。

检验前处理对检验结果影响重大，尤其是住院患者，病房采血时间较早(一般在早晨5：00 -6：00)，标本送至实验室检测时已经过了实验测定的规定时间，影响实验结果。本研究结果提示，标本放置时间对PL-11血小板功能检测存在影响，在检测健康人或已服用抗血小板药物治疗的患者时，AA诱导血小板聚集受时间影响较小，但ADP与胶原诱导血小板聚集随着标本放置时间延长，血小板聚集率降低。因此，PL-11检测血小板功能时，AA诱导应在采血后4 h内完成，ADP和Col诱导应在采血后2 h内完成。

1 Guan J， Cong Y， Ren J， et al. Comparison between a new platelet count drop method PL-11， light transmission aggregometry，VerifyNow aspirin system and thromboelastography for monitoring short-term aspirin effects in healthy individuals［J］. Platelets，2014， 26（1）： 25-30.

2 关杰，任军伟，朱远，等.光学比浊法与连续血小板计数法监测血小板聚集功能的比较［J］ .解放军医学院学报，2013，34（8）：838-841.

3 Duke WW. The relation of blood platelets to hemorrhagic disease. Description of a method for determining the bleeding time and the coagulation time and report of three cases of hemorrhagic disease relieved by transfusion［J］. JAMA， 1910， 55：1185-1192.

4 Massberg S， Brand K， Grüner S， et al. A critical role of platelet adhesion in the initiation of atherosclerotic lesion formation［J］. J Exp Med， 2002， 196（7）：887-896.

5 Zhang YT， Zhao YM， Ji SD， et al. Evaluation of a new method and instrument for detection platelet aggregation function and its clinical application［J］. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi， 2013， 21（3）：674-677.

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7 Harrison P， Mackie I， Mumford A， et al. Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function［J］. Br J Haematol， 2011， 155（1）： 30-44.

8 Cattaneo M， Cerletti C， Harrison P， et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry： A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH［J/OL］. http：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ jth.12231/abstract.

9 陈兴明，李祖兰，刘香玲，等.血标本室温放置时间对血小板聚集的影响［J］.现代检验医学杂志，2013，28（6）：76-77.

10 Johnston LR， Larsen PD， La Flamme AC. Methodological considerations for the assessment of ADP induced platelet aggregation using the Multiplate （R） analyser［J］. Platelets， 2013， 24（4）：303-307.

Effects of sample storage time on platelet function tested with PL-11 analyzer

ZHU Yuan1, GUAN Jie2, TIAN Yueqiang1, LI Li1, PING Muye1, REN Junwei3, DENG Xinli1, CONG Yulong1
1Department of Clinical Laboratory in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Clinical Laboratory, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China;3Department of Clinical Laboratory, Beijing North Hospital of China North Industrise Group Corporation, Beijing 100089, China

CONG Yulong. Email: yulongc@263.net

ObjectiveTo identify the effects of storage time on platelet function tested with PL-11 analyzer under room temperature.MethodsCitrated antecubital vein blood samples of graduate students in grade 2012 of Chinese PLA Medical School (n=20) and coronary heart disease (CHD) outpatients (n=20) treated with dual-antiplatelet drugs in the department of cardiology were drawn and tested by PL-11 analyzer at 3 testing points: 2, 4 and 8 hours after blooding. The maximum platelet aggregation ratio was tested with 3 different activators: arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP) and collagen.ResultsHealthy young men: AA-induced platelet aggregation ratio showed no difference between 2 h, 4 h and 8 h (P＞0.05). When ADP used as the activator, platelet aggregation ratio reduced apparently at 4 h compared with 2 h (P＜0.01), and it reduced to 4.3% at 8 h (P＜0.01). There was a clear reduction of collagen-induced platelet aggregation at 4 h compared with 2 h (P＜0.01), while no difference was found between 4 h and 8 h (P＞0.05). Patients treated with dual-antiplatelet drugs: AA-induced results showed no statistic difference between 2 h, 4 h and 8 h (P＞0.05). ADP-induced results showed an obvious reduction at 4 h, while no difference was found between 4 h and 8 h (P＞0.05). Collagen-induced aggregation ratio reduced apparently at 8 h after blood sampling (P＜0.01).ConclusionStorage time affects the results of PL-11 platelet function test with limited influence on AA-induced platelet aggregation ratio, whatever in healthy men or patients treated with dual-antiplatelet drugs. ADP- or collagen-induced platelet aggregation ratio reduces as the time delay extending. The time delay between collection, transport and analysis should ideally be preferable in 4 hours when AA used as activator or 2 hours when ADP and collagen used as activators. Keywords: platelet aggregation; pre-analysis control; PL-11; storage time

R 446.1

A

2095-5227(2015)06-0611-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.06.024

时间：2015-03-24 10:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150324.1013.002.html

2015-02-09

朱远，男，在读硕士。Email: 3466591133@qq.com

丛玉隆，男，主任医师，教授，博士生导师。Email: yu longc@263.net