保护性自噬对顺铂诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的抑制作用探讨

杨 翠，王 猛，武 超，夏 泉，许杜娟，

(1．安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032;2．安徽省立医院，安徽合肥 230001 3．安徽医科大学第一附属医院，安徽合肥 230022)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，化疗是乳腺癌治疗的一项重要措施，术后化疗可以消灭人体内可能已存在的微小转移灶或微小残余病灶，延长病人无病生存期及总生存。有相关的文献报道化疗药物顺铂联合17-Demethoxy-reblastain或吉西他滨治疗三阴性乳腺癌［1－2]，紫杉醇联合顺铂能有效地抑制人乳腺癌MCF-7的增殖［3]，许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现对肿瘤细胞的杀伤作用。自噬是一种细胞内溶酶体依赖性代谢过程，通过更新和消除缺损的或多余的蛋白质和受损或老化的细胞器来维持细胞稳态［4]。在哺乳动物细胞中，自噬大致分为三种:(1)巨自噬是主要的自噬形式;(2)微自噬是溶酶体的膜直接包裹胞质中的成分，形成一个内在的囊泡并在溶酶体降解;(3)分子伴侣介导的自噬(CMA)是胞浆中的蛋白质与分子伴侣结合后被转运到溶酶体腔，从而被溶酶体消化的过程。自噬是一个动态过程，可人为的将它分为四个阶段［5]:(1)诱导和起始，而在这一过程受哺乳动物雷帕霉素(mTOR)靶点的负调控;(2)成核，受Beclin1和hVps34/classⅢ PtdIns3K复合体调控;(3)自噬体的形成，随着隔离膜边缘的融合，被包裹的胞质成分完全被隔离开形成自噬体;(4)成熟和降解，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解所包裹的成分，降解产物在细胞内再循环利用。近年来的研究显示，自噬在肿瘤的治疗中有不可忽视的作用，而且自噬与凋亡的关系十分密切［6]。最近研究显示，顺铂能诱导人癌细胞如肝癌、宫颈癌、皮肤癌等自噬，并且这种自噬对肿瘤细胞是一种保护性机制，降低肿瘤对化疗药物顺铂的敏感性［7－9]。但是，顺铂是否能诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生自噬尚无报道。本研究观察了顺铂处理乳腺癌MCF-7细胞后自噬的发生，并初步探讨了自噬在顺铂诱导凋亡中的作用。

1 材料与方法

1．1 细胞株和主要试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7(安徽医科大学基础医学院沈玉先教授惠赠);DMEM高糖培养液(Hyclone生物技术有限公司);新生小牛血清(杭州四季青);甲基偶氮唑蓝(MTT);吖啶橙(AO)，氯喹(Chloroquine)，Hoechst 33342，顺铂购自于sigma公司，p62/SQSTM1抗体购自MBL公司，LC3和PARP抗体购自cell signaling公司。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 人乳腺癌MCF-7为贴壁的细胞株，采用含10%热灭活的新生小牛血清(FCS)的高糖培养基DMEM培养液，并加入青霉素100 IU·mL－1和链霉素 100 mg·L－1的培养体系于 37℃，5%的CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1．2．2 MTT检测细胞活力 取对数生长期MCF-7细胞，0．25%胰酶消化后用DMEM培养基制成单细胞悬液，以每毫升5×104个细胞密度接种于96孔培养板中，每孔100μL。培养24 h后分别加入既定浓度的顺铂，每组设5个复孔，每孔终体积200μL。分别培养24 h和48 h后，加入5 g·L－1的MTT每孔20μL，继续培养4 h后弃去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)每孔150μL，微振荡器上震荡10 min，酶标仪测490 nm波长处的吸光度值，取各组均值，重复实验3次。

1．2．3 细胞凋亡检测 细胞以每孔3×105个种在6孔板中，分为对照组、顺铂组、氯喹组、顺铂+氯喹组，处理24 h后，弃去培养基，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤1次，固定在4%的低聚甲醛15 min，然后用PBS溶解的2 mg·L－1Hoechst 33342每孔加入1 mL，PBS洗2次(10 min)，荧光显微镜观察核染色。

1．2．4 吖啶橙(AO)分析酸性自噬囊泡 细胞以每孔2×105个接种到6孔板中，培养24 h贴壁，用不同浓度的顺铂处理24 h后，PBS洗涤2次，用吖啶橙染色(最终浓度为2 mg·L－1)室温避光15 min，然后用PBS洗涤2次，荧光显微镜观察酸性囊泡自噬体。

1．2．5 Western blot检测 p62、LC3Ⅰ/Ⅱ、PRAP 蛋白表达 收集对照组和处理组MCF-7细胞，4℃预冷的PBS洗涤3次，加入适量的含有蛋白酶抑制剂100 mmol·L－1的PMSF的RIPA(1%聚乙二醇辛基苯基醚，1%脱氧胆酸，0．1%十二烷基硫酸钠)裂解液中于冰上裂解 30 min，4℃，12 000 r·min－1离心30 min，取上清，与5×蛋白上样缓冲液混合后煮沸10 min，将样品在10%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳，然后转印至硝酸纤维素膜(PVDF)上。用5%的脱脂牛奶封闭3 h后，加入既定的抗体，4℃过夜。Tris-HCL缓冲盐溶液(TBST)洗涤4次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温作用1 h，ECL法显色。

1．3 统计学分析 所有数据均为3次独立实验结果，均为计量资料，通过正态性检验，文中以(x±s)表示。采用SPSS 16．0统计软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组之间的比较采用t检验，P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 顺铂对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响 顺铂对乳腺癌MCF-7的抑制作用如图1A所示，顺铂从低浓度至高浓度(0，2，4，8，16，32 mg·L－1)分别作用于乳腺癌MCF-7细胞24 h和48 h后，均能剂量和时间依赖地降低细胞的存活率，同时Hoechst 33342染色分析不同浓度的顺铂(0、4、8、16 mg·L－1)作用于MCF-7细胞结果显示，顺铂呈剂量依赖性的诱导细胞的凋亡。如图1B所示。

2．2 顺铂诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬的发生

吖啶橙染色(acridine orange staining)观察用不同浓度的顺铂处理MCF-7细胞24 h后，自噬关键的形态学特征酸性自噬溶酶体的形成，如图2A所示8 mg·L－1顺铂能明显诱导酸性自噬溶酶体的形成;Western blot结果显示自噬标记蛋白LC3Ⅱ和p62水平分别呈剂量依赖性增加和减少，并且8 mg·L－1顺铂能够明显诱导LC3Ⅱ表达的增加及p62表达的减少(图2B)。同时，顺铂联合自噬抑制剂氯喹能够明显增加LC3Ⅱ的表达及抑制p62的降解(图2C)。以上结果表明顺铂诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的同时，也诱导了自噬的发生。

2．3 顺铂诱导乳腺癌MCF-7保护性自噬抑制了凋亡的发生 8 mg·L－1的顺铂和5μmol·L－1的氯喹(chloroquine，CQ)联合作用MCF-7细胞24 h，联合组与单药顺铂组相比，细胞存活率明显降低［(89．17%±2．56%)vs(74．63% ±1．51%)，P ＜0．05，图 3A]，Western blot结果显示，顺铂和氯喹联合凋亡蛋白PRAP出现明显的裂解(图3B)。我们的结果证实，抑制自噬增强了顺铂诱导的乳腺癌MCF-7细胞凋亡。

3 讨论

自噬是细胞通过双层膜包裹待降解物形成自噬体，然后运送到溶酶体形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新［10]。细胞在化疗、饥饿、缺氧等应激的条件下能激活细胞自噬的发生，并且自噬和凋亡密切相关。近年来研究显示，某些化疗药物如柔红霉素不仅能诱导肿瘤细胞的凋亡，而且激活了自噬［11]，以往的研究表明顺铂能诱导乳腺癌细胞的凋亡，但是顺铂能否诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬的发生尚无报道。我们的研究结果显示，随着顺铂浓度的提高，对MCF-7细胞增殖抑制和诱导凋亡作用明显增强，同时自噬相关蛋白LC3Ⅱ明显增加和p62水平明显减少，LC3和p62的特殊变化提示自噬被激活。自噬在肿瘤细胞中的作用是一把双刃剑，一方面，自噬的发生可抑制肿瘤细胞的生长［12];另一方面自噬的发生可促进肿瘤细胞的存活［13]，最终导致肿瘤细胞对化疗药物抵抗。Shimizu等［14]研究显示索拉菲尼诱导肝癌保护性自噬，用药理学自噬抑制剂能增强索拉菲尼的抗肿瘤活性，Shen等［15]研究表明血管内皮生长因子受(VEGFR)，表皮生长因子受体(EGFR)，和RET酪氨酸激酶小分子抑制剂ZD6474能提高胶质母细胞瘤自噬水平，抑制自噬能增加ZD6474的促凋亡作用。我们的结果显示，与顺铂相比，自噬抑制剂氯喹联合顺铂处理MCF-7细胞后，细胞的存活率明显下降，诱导凋亡作用明显增强。这说明，顺铂诱导MCF-7细胞保护性自噬，它部分抑制了顺铂诱导的乳腺癌细胞凋亡。

总之，顺铂诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡，同时也诱导了保护性自噬的发生。抑制自噬能增加乳腺癌对顺铂的敏感性，顺铂联合自噬抑制剂很可能成为治疗乳腺癌的新策略，为今后乳腺癌的临床治疗提供重要的理论依据。

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