围产期小鼠子宫颈中糖皮质激素受体、11β羟基类固醇脱氢酶的表达

李亭亭，田高强，罗明久，黄丽波，葛利江

(山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)

围产期小鼠子宫颈中糖皮质激素受体、11β羟基类固醇脱氢酶的表达

李亭亭#，田高强#，罗明久，黄丽波，葛利江*

(山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)

旨在揭示糖皮质激素(GC)及糖皮质激素受体(GR)、11β羟基类固醇脱氢酶1和2(11βHSD-1和2)对围产期小鼠子宫颈成熟的影响和机制。选取围产期5个时间点，分别为产前48 h(-48 h)、产前24 h(-24 h)、分娩时(0 h)、产后12 h(+12 h) 和产后48 h(+48 h)。首先通过ELISA检测血清皮质酮浓度变化，再通过免疫组化对GR和影响GC活性的两个酶，11βHSD-1和11βHSD-2，进行免疫定位和半定量检测。ELISA结果显示围产期GC浓度呈先升高后下降趋势，分娩时达到峰值(P<0.01)。免疫组化结果显示，11βHSD-1、11βHSD-2和GR在子宫颈腔上皮、基质、血管和平滑肌细胞上均有分布，11βHSD-1/11βHSD-2平均光密度的比值呈现先升高再下降趋势，分娩时比值最高；GR的表达量也是分娩时最高，分娩前后较低的趋势(P<0.01)。以上结果提示11βHSD-1合成的糖皮质激素通过其受体在子宫颈的成熟过程中起着关键性作用。

糖皮质激素；11βHSD-1；11βHSD-2；糖皮质激素受体；小鼠；免疫定位

糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)是肾上腺皮质层束状带合成和分泌的一类甾体激素，在机体的代谢和应激等过程中起着重要的作用。11βHSD-1和 11βHSD-2 是调节糖皮质激素活性的转化酶，二者作用相反，分别可以活化/失活GC，共同调节局部组织细胞内糖皮质激素的活性。

糖皮质激素受体(GR)是由核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)编码的一条多肽链组成的磷酸化蛋白质，与GC结合形成GC-GR复合物，通过和靶基因中的GC反应元件相互作用，最终引起各种生物学效应[1]。研究表明，糖皮质激素是参与分娩的重要激素[2]，绵羊、牛、小鼠等在妊娠晚期及分娩后胎盘、子宫、胎儿或母体血管中均有GR表达，GC与GR 结合可引起前列腺素分泌增加，促使宫缩加强[3-4]。

宫颈成熟(cervical ripening)是正常分娩的必要条件。目前研究表明，子宫颈成熟不是继发于子宫收缩的被动过程，而是一个多种内分泌因素参与的主动耗能[5]、炎性细胞浸润的过程[6-7]。各种激素介质通过直接或间接对宫颈内免疫细胞的位置分布和相对数量的调控来发挥它们特有的生理功能使宫颈成熟软化。其中糖皮质激素及其受体和转换它的两个关键酶的作用一直备受关注，但其调控机制尚不清楚。本研究旨在对这一机制进行初步阐释。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雌雄昆明小鼠，购自山东大学实验动物中心，(80±5)日龄，体重40 g左右，其中雌鼠25只，雄鼠5只，给予充足的饮水和饲料，自然光照。将小鼠按雌雄3∶1的比例合笼。次日早晨发现阴道栓时记为妊娠第1天(D 1)，按采样时期不同分为5组，分别为产前48 h(D17)和24 h(D18)、0 h (D19)、产后12 h和48 h。

1.2 试剂和仪器

小鼠皮质酮ELISA试剂盒(DZE 20546，上海基尔顿生物科技)；兔抗人糖皮质激素受体多克隆抗体(ab 52190)、兔抗人11βHSD-1多克隆抗体(ab 39364)、兔抗人11βHSD-2多克隆抗体(ab 115696)(均购自英国Abcam公司)；超敏二步法免疫组化试剂盒(PV-9001，中山金桥)；DAB显色试剂盒(PA 110，北京天根)。

LEICA石蜡切片机；Labsystems Multiskan MS公司的酶标仪；Olympus显微照相系统。

1.3 样本采集和处理

所有小鼠摘除眼球采血，收集于干燥离心管中，室温静置30 min，1 000 r ·min-1离心10 min，取血清储存于-20 ℃冰箱，用于检测血清皮质酮浓度。采血后取小鼠新鲜子宫颈组织，生理盐水冲洗，放于4%多聚甲醛，4 ℃固定48～72 h；固定后组织再经水流冲洗1 d，酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋；连续切片，切片厚约4 μm，每隔5张取3张连续切片，用于免疫组化染色。

1.4 小鼠血清皮质酮的检测

应用ELISA法分别检测5组小鼠血清皮质酮的含量，小鼠皮质酮ELISA试剂盒检测浓度范围为8～150 μg·L-1；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.5 免疫组化(间接法)检测GR、11βHSD-1和11βHSD-2

1.5.1 主要染色步骤 切片常规脱蜡至水；0.8%胰蛋白酶消化修复抗原；含3% H2O2的甲醇溶液37 ℃湿盒内避光孵育30 min；兔抗人糖皮质激素受体多克隆抗体一抗工作液(1∶100稀释)，4 ℃冰箱湿盒内过夜孵育；相继滴加超敏二步法免疫组化试剂盒试剂1和试剂2，于37 ℃温箱中各孵育1 h。以上各步骤之间均以0.01 mol·L-1PBS 液充分洗涤3次，每次5 min。最后DAB显色以及苏木素复染，脱水，封片。

1.5.2 视野观察与统计 使用显微照相系统对子宫颈切片进行图像采集，每只小鼠取3张切片，每张切片随机选取5个视野，并在相同条件下拍照保存。用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析，测定单位视野中GR阳性颗粒的光密度值，取5个视野的平均值定为该样本的GR阳性颗粒的平均光密度值，平均光密度值越大表示蛋白含量越高。

11βHSD-1和2的免疫组化检测步骤同上。

1.6 统计分析

2 结 果

2.1 小鼠血清皮质酮浓度

产前48h、产前24h、分娩时、产后12h和产后48h血清皮质酮分别为(124.22±2.82)、(123.87±3.31)、(136.15±3.79)、(135.74±2.72)和(131.30±2.10)μg·L-1。血清皮质酮从产前48h至产前24h略有下降，二者差异不显著(P>0.05)；产前24h到分娩时GC浓度迅速上升，达到峰值，二者差异极显著(P<0.01)；产后12h时GC浓度略有降低，但与分娩时差异不显著(P>0.05)；产后48h时GC浓度显著下降，与其他四个时间点差异极显著(P<0.01)。

2.2 子宫颈中11βHSD-1和2的定位和半定量

免疫组化结果表明，11βHSD-1和11βHSD-2在细胞核和细胞质中均有表达，且主要为细胞核着色，阴性对照不着色(图1F、f)。产前48h时11βHSD-1和2在子宫颈腔上皮细胞和基质细胞中有少量表达(图1A、a)，从产前24h至产后48h在子宫颈中分布广泛，子宫颈腔上皮和基质细胞(图1B、D、b、d、e)，血管内皮(图1D、E、d、e)以及子宫颈平滑肌细胞(图1C、c、e)上均有分布，且主要分布在腔上皮和平滑肌细胞上。

平均光密度分析得出，产前48h至分娩期，11βHSD-1和11βHSD-2表达量逐渐升高，分娩时达到最大值(P<0.05)，产后12h表达水平显著下降(P<0.05)，其中11βHSD-1表达量在产后48h降低到产前48h水平，两者差异不显著(P>0.05)，11βHSD-2表达量在产后12h与产后48h差异不显著(P>0.05)，且维持在较高水平，但与产前48h相比差异极显著(P<0.01) (图2)。

2.3 子宫颈中GR的定位和半定量

GR蛋白定位在子宫颈细胞的细胞核中，细胞质中也检测到少量表达。经免疫组化DAB染色的切片，GR免疫反应阳性细胞呈深浅不等的棕黄色(图3)，阴性对照不着色(图3F)。结果显示，在产前48h时GR仅在子宫颈腔上皮细胞和基质中少量表达(图3A)；产前24h至产后48h，GR在子宫颈腔上皮和基质细胞(图3B，D)，腺管(图3D)，血管内皮(图3D，E)以及子宫颈平滑肌细胞(图3C，E)上均有分布，其中分娩时GR表达量最高。

Image-proplus6.0的分析显示，产前48h、产前24h、分娩时、产后12h和产后48hGR阳性细胞在小鼠子宫颈组织中的平均光密度分别为(0.008±0.004) 、(0.034±0.017)、(0.062±0.015)、(0.039±0.016)和(0.016±0.007)IOD·Area-1。GR阳性细胞在产前48h表达水平较低，平均光密度值最小，产前24hGR表达量迅速上升(P<0.01)，分娩时上升到最高水平(P<0.01)。产后GR表达量迅速下降，其中分娩时与产后12h差异极显著(P<0.01)，产后12h与产后48h差异极显著(P<0.01)，且产后48hGR表达量接近产前48h(P>0.05) 。

上述结果表明小鼠围产期5个时间点GR的平均光密度值呈现出先升高再降低。在分娩时GR的平均光密度值最高，与11βHSD-1/11βHSD-2的比值有着相似的变化趋势。

3 讨 论

糖皮质激素(GC)分为皮质醇和皮质酮，在不同种属动物体内分泌的种类和比例有所不同，牛、羊和人等体内以皮质醇为主，而鸟类、大鼠和小鼠、兔则以皮质酮为主。GC的生物学效应不仅取决于目标组织中GR受体的表达量还取决于糖皮质激素的代谢酶 (11βHSD-1和2)的表达含量与反应方向。11βHSD-1和2可催化糖皮质激素C11位的酮基与羟基之间的氧化还原反应，其中11βHSD-1能使无活性的可的松(脱氢皮质酮)还原为有活性的皮质醇(皮质酮)，而11βHSD-2的催化反应方向相反，使有活性的糖皮质激素失活。

本试验结果表明，GR蛋白与11βHSD-1和2表达部位一致，在小鼠子宫颈内膜基底层、间质、腺管、血管以及子宫颈平滑肌都有分布，说明糖皮质激素可通过自分泌或旁分泌的方式在子宫颈局部细胞内起作用。小鼠围产期5个时间点11βHSD-1和2的平均光密度曲线相似，说明11βHSD-1和2的表达量有着相似的变化趋势，都是在分娩时表达量最高。同时11βHSD-1/11βHSD-2的比值也呈现出“先升高再降低”的趋势。这与作者检测的小鼠围产期血清皮质酮浓度的变化规律相符，说明在分娩时11βHSD-1/11βHSD-2比值达到最大值，皮质酮活化反应更占优势，子宫颈局部组织细胞中GC浓度上升，参与宫颈成熟扩张。而在分娩前后皮质酮失活反应更占优势，子宫颈局部组织细胞中GC浓度下降，以减少糖皮质激素对宫颈的扩张作用，利于宫颈的产后修复。此外GR蛋白在分娩时表达水平的显著升高，增加了子宫颈对GC的敏感性，进一步加强GC对子宫颈成熟扩张的作用。

1.腔上皮；2.基质细胞；3.血管；4.平滑肌细胞；箭头表示11βHSD-1和11βHSD-2阳性细胞1.Luminal epithelium；2.Stromal cells；3.Blood vessels；4.Smooth muscle cells；Arrows represent immune positive cells of 11βHSD-1 and 11βHSD-2图1 围产期小鼠子宫颈中11βHSD-1和11βHSD-2免疫反应阳性细胞Fig.1 Immune positive cells of 11βHSD-1 and 11βHSD-2 in murine uterine cervix during the peripartal period

虽然糖皮质激素通过干扰NF-κB信号系统可抑制羊膜成纤维细胞以及大多数其他类型细胞内前列腺素合成酶(PTGS 2)的表达[8]，降低前列腺素浓度，但是在滋养层中包括羊膜和绒毛膜，糖皮质激素却可刺激PTGS 2表达和活性[9-12]。皮质醇可刺激羊膜PTGS 2转录以增强前列腺素的合成，并抑制绒毛膜前列腺素脱氢酶的活性从而抑制前列腺素代谢[13，15]。此外，糖皮质激素在分娩期可直接上调胎膜中前列腺素的合成[13-14]。

图2 子宫颈中11βHSD-1 和2免疫阳性细胞的平均光密度及11βHSD-1/11βHSD-2比值Fig.2 The mean optical density of 11βHSD-1 and 2 immunopositive cells in the uterine cervix and the quotient between mean optical density of 11βHSD-1 and 2

A.产前48 h；B.产前24 h；C.分娩期；D.产后12 h；E.产后48 h；F.阴性对照；1.腔上皮；2.基质细胞；3.血管；4.平滑肌细胞；5.腺管；箭头表示GR阳性细胞A.48 h antepartum；B.24 h antepartum；C.Term labor；D.12 h postpartum；E.48 h postpartum；F.Negative control；1.Luminal epithelium；2.Stromal cells；3.Blood vessels；4.Smooth muscle cells；5.Glandular epithelium；Arrows represent immune positive cells of GR图3 围产期小鼠子宫颈组织中GR免疫反应阳性细胞Fig.3 Immune positive cells of GR in murine uterine cervix during the peripartal period

而前列腺素在分娩启动和延续中起着关键作用，已有研究证明，内源性前列腺素PGE 2参与宫颈成熟[16]。PGE 2可破坏子宫颈上皮细胞间的结构和结缔组织中的胶原纤维和弹性蛋白[17]，使结缔组织和上皮变得松散软化。分娩时PGE 2主要产生于羊膜，绒毛膜，蜕膜组织还有母体胎盘[ 18-20 ]。我们另一项研究发现在分娩时PGE 2在宫颈组织中分布广泛，除了存在于脂肪细胞外，还存在于腔上皮、血管，腺管，平滑肌和浆膜[5]，说明子宫颈也是PGE 2旁分泌或自分泌的部位。因此，推断子宫颈局部组织中由11βHSD-1和2共同调节的糖皮质激素及其受体与宫颈内PGE 2有密切联系，糖皮质激素在分娩期可能是通过增加子宫颈局部组织PGE 2的浓度使子宫颈成熟扩张。

顾国生等已证明[5]，山羊子宫颈平滑肌中前列腺素松弛型受体EP 2和EP 4蛋白在分娩期的表达量显著升高，这与小鼠子宫颈中的糖皮质激素受体的表达规律也相符。PGE 2通过与其受体EP 1、EP 2、EP 3和EP 4结合使分娩正常启动。PGE 2与EP 2、EP 4结合后刺激腺苷酸环化酶的分泌，通过提高cAMP的分泌来诱导子宫颈平滑肌松弛[21]。此外，有研究表明糖皮质激素可通过增加离体培养的子宫平滑肌组织中的前列腺素水平而增加子宫的收缩力[22]。糖皮质激素在子宫组织中产生的不同生物学效应可能与前列腺素受体在不同组织中的特异性表达相关。不同组织细胞分泌的PGE 2可以通过跨膜G蛋白偶联EP超家族来激活不同细胞内通路以引起子宫和宫颈的收缩或松弛[23-25]。分娩期子宫组织中前列腺素受体EP 1和EP 3大量表达分布，其中EP 1是收缩性受体，前列腺素通过与其结合直接使子宫收缩，而EP 3是通过降低cAMP的表达来抑制子宫平滑肌的舒张来间接使子宫处于收缩状态。

4 结 论

分娩时子宫颈局部组织中由11βHSD-1合成糖皮质激素及其受体大量增加使子宫颈成熟软化，分娩后子宫颈局部组织糖皮质激素水平的降低使子宫颈恢复到分娩前的状态，因此糖皮质激素及其受体与小鼠子宫颈成熟有密切关系。

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(编辑 白永平)

Expression of Glucocorticoids Receptor，11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase in the Cervices of Peripartal Mice

LI Ting-ting#，TIAN Gao-qiang#，LUO Ming-jiu，HUANG Li-bo，GE Li-jiang*

(CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

The present study was designed to examine the pattern and cellular localization of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase(11β-HSD) enzymes and glucocorticoids receptor(GR) gene expression in the murine cervix during peripartal period，and to gain insight into the role of glucocorticoid(GC) and GR，11β-HSD-1 and 2 in the cervical ripening of peripartal mice.Mice in five groups were from 48 h before birth(-48 h) and-24 h，at term labor(0 h)，12 h after birth(+12 h) and +48 h.The dynamic change of the serum corticosterone level was determined by ELISA and immunolocalization of GR，11βHSD-1 and 2 which influence glucocorticoid’s activity in cervix was assayed by immunohistochemistry.The results suggested that the levels of serum corticosterone were significantly increased before the onset of labor，reached the maximum during delivery(P<0.01).In addition，the 11βHSD-1，11βHSD-2 and GR protein were localized to the nuclei of cervical luminal epithelia，stromal cells，vascular and cervical smooth muscles.The quotient between mean optical density of 11βHSD-1 and 2 is highest at parturition.Furthermore，the immunoreactivity of GR also reached the peak at parturition(P<0.01).These results revealed that 11βHSD-1-regenerated glucocorticoids may act via its receptor to play an important role in the final cervical ripening.

glucocorticoids；11βHSD-1；11βHSD-2；glucocorticoid receptor；mice；immunolocalization

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.024

2015-03-04

山东省自然科学基金(ZR2010CM052)

李亭亭(1989-)，女，山东嘉祥人，硕士，主要从事动物生殖疾病与生殖内分泌的研究，E-mail：litingting0516@126.com。田高强为共同第一作者

*通信作者：葛利江，E-mail：glj@sdau.edu.cn

S857.2

A

0366-6964(2015)11-2097-07