松树皮原花青素对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用*

张文艳， 孙宝飞， 余资江**， 余 彦， 肖朝伦， 王玉林， 罗时鹏， 令狐艳

(1.贵阳医学院 基础医学院 人体解剖学教研室， 贵州 贵阳 550004；2.贵阳医学院附院 呼吸内科， 贵州 贵阳 550004)



松树皮原花青素对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用*

张文艳1，2， 孙宝飞1， 余资江1**， 余 彦1， 肖朝伦1， 王玉林1， 罗时鹏1， 令狐艳1

(1.贵阳医学院 基础医学院 人体解剖学教研室， 贵州 贵阳 550004；2.贵阳医学院附院 呼吸内科， 贵州 贵阳 550004)

目的： 探讨松树皮提取物原花青素对缺血再灌注小鼠脑损伤海马神经元的保护作用。方法： 120只雄性昆明小鼠随机分成正常对照组、假手术组、14 d模型组、28 d模型组、14 d治疗组、28 d治疗组，采取小鼠双侧颈总动脉结扎缺血15 min，再灌注15 min构建脑缺血再灌注损伤模型，治疗组给予松树皮提取物原花青素灌胃治疗， Morris水迷宫实验观察小鼠学习记忆能力的变化，造模后第14、28天处死小鼠，HE染色法观察小鼠脑组织病理形态学改变，透射电子显微镜观察海马神经元超微结构的改变。结果： Morris水迷宫结果显示模型组小鼠学习记忆能力降低，与模型组相比，治疗组小鼠学习记忆能力有所提升；14 d模型组脑细胞数量较假手术组明显减少，胞浆着色浅，胞核移位，治疗组尼氏体排列欠规律，部分细胞形态不规则，胞浆着色相对较浅，但比模型组好；电镜下，小鼠海马CA3区神经元在14 d模型组损伤严重，神经元胞体水肿、出现核固缩溶解现象，存在细胞器溶解后形成的空泡，线粒体嵴可见有断裂，细胞出现凋亡小体， 28 d模型组有所恢复，14 d和28 d治疗组神经元较同期模型组轻。结论： 松树皮提取物原花青素对脑缺血再灌注损伤小鼠具有保护作用。

松树皮提取物；原花青素；再灌注损伤；海马；显微镜检查，电子，扫描；细胞保护

脑缺血再灌注后引起的不可逆性的脑功能损害是临床治疗的难点。脑损伤后，神经细胞的死亡可分为2种，一种是直接损伤引起的细胞死亡，第二种是继发性损伤引起的迟发性细胞死亡，目前对直接损伤引起的细胞死亡还无法避免，而对继发性神经细胞损伤的保护作用是当今脑保护治疗的关键[1]。松树皮提取物中含有原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)，具有极强的抗氧化活性，是一种很好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂[2-3]。本研究以脑缺血再灌注小鼠为研究对象，观察松树皮提取物OPCs对脑缺血再灌注损伤小鼠学习和记忆能力的影响，同时观察小鼠海马超微结构变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年昆明种雄性小白鼠120只， 体重20～22 g，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号为SCXK[(黔)2002-0001]，按随机分组原则，将120只小鼠分为正常对照组、假手术组、14 d模型组、28 d模型组、14 d治疗组和28 d治疗组，每组各20只。室温为(20±2)℃，湿度48%～60%。

1.2 实验试剂及仪器

松树皮提取物(西安赛奥生物技术有限公司)，Morris水迷宫(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)，透射电子显微镜(FEI公司TECNAI10)。

1.3 脑缺血动物模型建立

小鼠以3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，常规消毒，自下颌骨到胸骨柄间作5～8 mm长的颈部正中切口，游离双侧颈总动脉及伴行神经，微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，缺血15 min，然后松开微动脉夹，恢复血液灌注15 min，如此反复3次造成小鼠脑缺血再灌注损伤。以观察到小鼠出现惊厥、呼吸深慢、心跳加快为脑缺血模型成功的标志。假手术组除不夹闭颈总动脉外，其余操作同模型组。治疗组在处死前7 d给予松树皮提取物OPCs(100 mg/kg)灌胃治疗，每日1次。正常对照组、假手术组、模型组用等量生理盐水灌胃。

1.4 学习记忆能力测试

Morris水迷宫实验水池，平台距液面1 cm。将水池分为NE、SE、SW、NW四个象限，水温为25 ℃。定位航行实验检测小鼠学习能力：每次将小鼠放入水池中(不放平台)自由游泳60 s 使其熟悉迷宫环境，实验共历时5 d，每天训练4次(固定时间段)；将平台固定放置于NW象限中间，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。记录小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，4次训练均将小鼠分别从4个不同的起始点(不同象限)放入水中；小鼠找到平台后，在平台上休息30 s再进行下一次试验；60 s内找不到平台的小鼠，则由实验者将其引导至平台，同样休息30 s后再进行下一次试验，潜伏期记为60 s；统计第5天小鼠4次训练潜伏期的平均值作为其学习成绩。空间探索实验检测小鼠记忆能力：定位航行试验结束后将撤除平台，将所有小鼠于同一点(任选某一象限中点)面对池壁放入水中，记录 60 s内小鼠穿越原平台所在象限时间作为评估指标[4]。

1.5 取材

脑缺血再灌注后第14、28天每组分别处死10只小鼠。每组取8只小鼠在相应时间点麻醉、处死、灌注固定，用于HE染色；脑缺血再灌注后第14、28天每组取出2只小鼠缺血侧大脑海马组织，切成约1 mm3小块，行透射电镜观察并摄片。

1.6 HE染色

各组脑组织在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成蜡块，连续切片，厚5 μm，常规行HE染色，观察病理形态学改变。

1.7 海马神经元超微结构的观察

每组取出海马组织块放入2.5%戊二醛固定24 h，1%锇酸后固定2 h，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，半薄切片定位，超薄切片，铀染，铅染，利用FEI-TECNAI10透射电子显微镜观察并摄片，以观察海马超微结构变化。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠脑组织病理变化

海马区脑组织病理学染色(200倍光学显微镜下)显示：假手术组排列整齐，可见有浅染的突起(图1A)；与假手术组比较，14 d模型组细胞数量明显减少，排列稀疏，胞体形态不规则，部分细胞坏死，胞浆着色浅，胞核移位(图1B)。OPCs治疗组尼氏体排列不规律，部分细胞形态不规则，胞浆着色相对较浅，但比模型组好(图1C)。

A为假手术组，B为14 d模型组，C为14 d治疗组

2.2 学习记忆能力

在定位航行实验中，假手术组与正常对照组结果无差异(P>0.05)，14 d、28 d模型组小鼠逃避潜伏期明显高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，同时28 d模型组小鼠成绩优于14 d小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；第14、28 d治疗组小鼠需要更少的时间来找到隐藏于水面之下的站台，成绩优于同期模型组(P<0.05)。空间探索实验中，假手术组与正常对照组结果无差异(P>0.05)，与假手术组相比，14 d和28 d模型组小鼠穿越原平台所在象限时间明显降低(P<0.05)，表明其记忆能力明显降低，其中14 d模型组降低更明显；与同期模型组相比治疗组记忆能力有所好转，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 小鼠海马CA3区神经元超微结构

电镜下，假手术组及正常对照组小鼠海马CA3区神经元胞核形态规则，核膜光滑、完整，染色质分布均匀；胞浆细胞器丰富，粗面内质网分布规则，表面附有较多的核糖体颗粒，线粒体发达，其表面双层膜和内部嵴清晰；细胞核及细胞器形态规则(图2A-B)。14 d模型组海马CA3区损伤严重，神经元胞体水肿，出现核固缩溶解现象，电子密度增高，胞浆中存在细胞器溶解后形成的空泡，残存线粒体膜破坏严重，线粒体嵴可见有断裂 (图2C)。28 d模型组海马CA3区较14 d组比较有所恢复，神经元胞体水肿减轻，电子密度增高，核膜边界不清，间隙较大，染色质电子致密度增高，细胞器较假手术组减少，线粒体肿胀，可见嵴断裂，少量线粒体嵴消失，粗面内质网囊状扩张(图2E)。14 d治疗组海马CA3区神经元较模型组受损减轻，胞体水肿现象减轻，细胞膜边界欠清晰，细胞器数量增多，部分线粒体轻度肿胀，双层膜结构不清，粗面内质网囊状扩张(图2D)；28 d治疗组小鼠海马CA3区同假手术组相比有一定差异，神经元细胞核形态较规则，电子密度相对较高，胞浆内线粒体数量减少，偶见少量线粒体轻度肿胀(图2F)，与28 d模型组比较细胞损伤有不同程度的减轻。

表1 小鼠Morris水迷宫实验结果比较Tab.1 Comparison of result of Morris water maze test

(1)与正常组比较，P<0.05；(2)与14 d模型组比较，P<0.05；(3)与28 d模型组比较，P<0.05

A为正常对照组；B为假手术组；C为14 d模型组；D为14 d治疗组；E为28 d模型组；F为28 d治疗组

3 讨论

脑组织缺血将会导致局部脑组织及其功能的损害，其损害程度与缺血时间长短及残存血流量多少有关，短期不完全性缺血只引起可逆性损害，而长时间的完全缺血或严重缺血会引起梗死。缺血后的血流恢复在某些情况下能导致进一步的组织损伤和功能障碍，恢复血流灌注后的有害情况称为缺血再灌注损伤，抑制再灌注损伤成为目前治疗缺血性脑卒中的关键环节[5]。大量的研究表明，OPCs为有效的抗氧化剂，且无毒，无致突变性，无致癌性，无副作用[6]。

本研究采用了经典生理实验Morris水迷宫来研究脑缺血再灌注后小鼠学习记忆能力的变化，发现小鼠缺血再灌注后学习记忆能力下降，在14 d损伤较重，28 d后相对减轻，可能与小鼠的自身修复有关，同既往研究结果相一致[7]。本实验在给予原花青素治疗7天后各组小鼠学习和记忆能力有显著提升，说明原花青素对缺血再灌注小鼠学习记忆能力有明显改善作用，王珠等[8]研究也发现葡萄籽原花青素能改善脑缺血再灌注大鼠的学习记忆功能。

本研究通过透射电镜观察到脑缺血再灌注损伤后小鼠海马部位神经元细胞核及胞浆内细胞器发生了一系列病理改变。其中线粒体是细胞生物氧化的主要场所，当线粒体受到损伤后可能引起细胞内供能发生障碍，其结果将导致细胞凋亡或坏死，组织功能减退，其作用机制可能与缺血再灌注的直接作用、氧化应激、诱导凋亡等因素有关[9]。本实验14 d模型组线粒体嵴破坏严重，细胞出现凋亡小体，14 d治疗组较模型组超微结构有所好转。近期研究表明原花青素能够改善神经细胞的超微结构，进而保护低氧大鼠避免进一步脑损伤[10]。原花青素改善神经细胞可能是抑制缺血再灌注损伤中核转录因子-кB的表达，阻断核转录因子-кB诱导的细胞因子表达的反应链，从而抑制细胞凋亡最终起到保护作用[11]。

此外，原花青素作为一种高效的抗氧化剂和自由基清除剂，能够提高超氧化物歧化酶的活性，促进一氧化氮的产生，并降低血清内皮素的水平，从而发挥抗缺血再灌注损伤的作用；通过对炎症因子表达的抑制，从而减轻脑缺血再灌注损伤[12]。因此，原花青素可能通过多种途径保护脑缺血再灌注损伤脑组织，其具体机制有待进一步研究。

[1] 翟婷婷,蔡红艳,云爱华.原花青素对脑缺血再灌注损伤羟自由基含量和肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].中国实用医药, 2014(22):256-257.

[2] 于立梅,赵谋明,李莹.基于响应面法的马尾松树皮原花青素提取及抗氧化性研究[J].食品与机械, 2007(1):64-68．

[3] 黄澈,闵鹤鸣,闵连秋,等.原花青素对脑缺血再灌注后大鼠海马内质应激相关分子GRP78和CHOP表达的影响[J].中国新药杂志, 2011(2):156-161.

[4] Peng Y. Hyperbaric oxygen preconditioning ameliorates anxiety-like behavior and cognitive impairments via upregulation of thioredoxin reductases in stressed rats[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2010(6):1018-1025.

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[6] 段国平,刘晓利,赵丕文.葡萄籽原花青素的药理学研究进展[J].环球中医药, 2014(4):313-316.

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[10]赵雅宁,曹书华,郭霞,等.葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应及学习记忆能力的影响[J]. 2014(491):29 -32.

[11]刘莹,张花治,白丽君,等.原花青素对视网膜缺血再灌注损伤大鼠视网膜结构及转录因子-κB 表达的影响[J],中国中医药信息杂志, 2013(5):32-34.

[12]陈荣志,陆景红,任明山,等.葡萄籽原花青素对大鼠脑缺血再灌注后NF-κB 、I-κB及iNOS的影响[J].华西药学杂志, 2007(3):266-268.

(2015-01-29收稿，2015-03-08修回)

中文编辑： 周 凌；英文编辑： 刘 华

Protective Effects of Pine Bark Extract on Brain after Cerebral Ischemia-reperfusion in Mice

ZHANG Wenyan1,2, SUN Baofei1, YU Zijiang1, YU Yan1, XIAO Chaolun1, WANG Yulin1, LUO Shipeng1, LINGHU yan1

(1.DepartmentofAnatomy,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofRespiratory,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To explore the protective effect of procyanidin extracted from pine bark on hippocampus neurons of mice subjected to ischemia reperfusion brain injury. Methods: A total of 120 male Kunming mice were randomly divided into 6 groups, namely normal control group, sham operation group, 14-day model group, 28-day model group, 14-day treatment group and 28-day treatment group. The model of cerebral ischemia-reperfusion injury was constructed by bilateral carotid ligation ischemia for 15 minutes, and ischemia reperfusion for another 15 minutes. The treatment group was continuously given procyanidins by intragastric administration for 7 days before execution, and other groups were given the same amount of normal saline by intragastric administration. The change of memory capacity was observed in Morris water maze test. When mice were killed 14 and 28 days after model construction, the pathological changes of mice brain tissue were observed by HE staining method and the hippocampus ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Results: The result of Morris water maze test showed that compared with model group, learning and memorizing ability in treatment group was improved to some extent. Compared with sham operation group, cells number in 14-day model group was significantly decreased, cytoplasmic staining was light and cell nucleus was tanslocated. In treatment group the tigroid body was arranged irregularly, some cells was in irregular shape and cytoplasmic staining was relatively light. However, the situation in treatment group was better than that in model group. In 14-day model group, hippocampus CA3 neurons of mice were seriously damaged, pericaryon was in edema, karyopyknosis dissolving phenomenon occurred, organelles dissolved and formed vacuole, the mitochondrial cristae fracture was broken, and the apoptotic bodies occurred in cells. In 28-day model group, some recovery could be found. In 14-day treatment group and 28-day treatment group, the above-mentioned situation in neuron improved compared with same period of other model group. Conclusion: The procyanidins extracted from pine bark has the function of protecting mice subjected to cerebral ischemia reperfusion injury.

pine bark extract; proanthocyanidins; reperfusion injury; hippocampus; microscopy, electron, scanning; cytoprotection

贵州省科技厅社会发展攻关黔科合SY字(2012)3144号

时间：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1236.009.html

R743.9; R961

A

1000-2707(2015)05-0450-05

**通信作者 E-mail:yzj0112@126.com