丹红注射液对血管性痴呆大鼠认知障碍改善作用及其机制研究*

陕西省人民医院神经内二科(西安 710068)

郭荷娜 王 倩 杨 谦

丹红注射液对血管性痴呆大鼠认知障碍改善作用及其机制研究*

陕西省人民医院神经内二科(西安 710068)

郭荷娜 王 倩 杨 谦

目的：观察丹红注射液对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响，并探讨其作用机制。方法：将SD大鼠随机分为假手术组、对照组和丹红组，每组又分为6h、24h、72h、1w、1m (n= 6) 四个亚组。采用双侧颈总动脉永久性阻断法( 2-VO) 建立VD 大鼠模型，暗回避反应法测定学习记忆能力；应用免疫组织化学法、原位末端标记法检测大鼠海马CA1区HIF-1α表达及凋亡细胞数的变化。结果：①2-VO术后72h凋亡细胞数最多，与对照组相比，丹红组各时间点凋亡细胞数目显著减少；②6h时丹红组潜伏期与对照组比较无统计学意义，从24h开始丹红组各时间点潜伏期显著延长;③6h时丹红组HIF-1α蛋白表达与对照组无明显统计学差异，24h丹红组表达明显升高，而从72h之后HIF-1α蛋白表达显著降低。结论：丹红注射液对血管性痴呆大鼠学习记忆障碍具有改善作用，其机制可能与调节了HIF-1α蛋白表达，减少了海马CA1区的细胞凋亡有关。

丹红注射液由丹参、红花提取而成，具有活血化瘀、通脉舒络之功效。临床试验[1-2]证实其有改善血管性痴呆患者学习记忆功能的作用，但具体的作用机制目前尚不明确。本研究旨在探讨丹红注射液对血管性痴呆大鼠认知功能的影响，并通过研究其对海马CA1区细胞凋亡及低氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)表达的影响来探讨其机制。

材料与方法

1 实验动物的选择及模型的建立 参照刘梅[3]等被动避暗回避反射试验测定大鼠学习记忆能力。对健康SD大鼠进行初筛，将实验大鼠背对洞口放入明室，启动计时器，90s内进入暗室的大鼠纳入实验。采用的双侧颈总动脉永久性阻断法( 2-VO)制作血管性痴呆动物模型[4]。以20% 水合氯醛0.6mg/ kg 腹腔注射麻醉大鼠，取颈前正中切口，钝性分离双侧颈总动脉(CCA) ，以1号手术线双重结扎，逐层缝合。

2 动物分组及处理 将纳入实验的雄性SD大鼠90只，体重200～250g，随机分为三组，每组30只。

2.1 丹红组：术前3 d 至术后1 周，每天给予丹红注射液0.5ml/kg腹腔注射，手术当天于结扎前1h 给药，建2-VO模型。

2.2 对照组：于相同的时间分别给予等量氯化钠溶液腹腔注射，余条件同丹红组。

2.3 假手术组：仅分离暴露双侧CCA 而不结扎，然后逐层缝合。每组再根据缺血时间随机分为5个亚组( 每组6只):6h组(6h)、24h组(24h)、72h组(72h)、1周组(1w)及1月组(1m)。

3 学习记忆能力测定 术前3d及术后每天均对大鼠进行学习训练，大鼠背对洞口放入明室，进入暗室后通电刺激2s，电刺激后5s取出大鼠，归笼饲养。测定时再将大鼠背对洞口放入明室，同时开启计时器，记录大鼠第一次进入暗室时间，即潜伏期(STL)。术后6h、24h、72h、1周、1月各时间点的大鼠均于处死前再次行避暗回避反射试验测定学习记忆成绩。

4 标本制备和检测方法 6h、24h、72h、1周、1月各时间点再次麻醉大鼠，开胸灌注，断头取脑，置于4%聚甲醛中12h，于视交叉前缘行2mm厚冠状切片，依次脱水、透明、浸蜡及包埋，5μm厚连续切片，TUNEL染色、HIF-1α免疫组化染色。在40×10光镜下每张切片随机选择5 个不同的视野，计数每个视野中1 mm×1 mm 面积中阳性细胞数，取其平均值。

5 统计学方法 应用SPSS 13. 0 统计学软件，所有数据以均值±标准差表示，组间比较采用方差分析和t检验法，取P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组不同时间点海马CA1区细胞凋亡情况 假手术组可见少量凋亡细胞。建模24h后对照组凋亡细胞数开始增加，72h凋亡阳性细胞数最多，之后减少。与对照组相比，丹红组各时间点凋亡细胞数目均显著减少 (P< 0. 01)；1月后丹红组凋亡细胞数与假手术组比较，差异无统计学意义，见表1。

2 各组不同时间点学习记忆能力测试结果 与假手术组相比，对照组及丹红组大鼠各时间点潜伏期均显著缩短(P< 0.01) ，提示双侧颈总动脉永久阻断后大鼠学习记忆能力明显下降，造模成功；与对照组各时间点相比，6h时丹红组潜伏期与对照组无明显统计学差异(P>0.05)，从24h开始丹红组各时间点潜伏期显著延长(P< 0.05) ，见表2。

表1 各组不同时间点海马CA1区凋亡细胞数目(/mm2)

注：与假手术组相应时间点相比，*P<0.01；与对照组相应时间点相比，△P< 0.01

表2 各组大鼠不同时间点潜伏期数值 (s)

注：与假手术组各时间点相比，*P<0.01；与对照组相比，△P< 0.05

3 各组不同时间点海马CA1区HIF-1α蛋白的表达 与假手术组相比，对照组及丹红组各时间点HIF-1α蛋白表达明显增加(P< 0.01)；6h时丹红组HIF-1α蛋白表达与对照组无明显差异(P>0.05)，24h丹红组表达明显升高(P< 0.05)，而从72h开始HIF-1α蛋白表达显著降低(P< 0.05)，提示丹红注射液可增加早期(24h)海马CA1区HIF-1α蛋白的表达，但从72h开始则开始下调这种表达，见表3。

表3 各组大鼠不同时间点海马CA1区HIF-1α表达( /mm2)

注：与假手术组相应时间点相比，*P<0.01；与对照组相应时间点相比，△P< 0.05

讨 论

丹红注射液主要成分包括丹参酮、丹参酚酸、红花黄色素等组成，具有活血化瘀，通脉舒络的功效[5]。另外还具有以下功能[6-8]：①降低血粘度、抗血栓形成；②激活和恢复红细胞变形能力，改善微循环、抗氧化损伤等作用；③上调BDNFmRNA表达，抑制血管内皮细胞因缺氧导致的细胞凋亡，修复和防治各种迟发性神经元损伤的作用，对脑组织有明显的保护作用。

被动暗回避反射实验中STL越短则学习记忆能力越差。实验发现经学习训练已达到对暗环境被动回避的各组大鼠，2-VO术后6h 后再次行暗回避实验时，对照组及丹红组大鼠STL明显短于假手术组，提示双侧颈总动脉永久性阻断可显著影响大鼠的学习记忆能力。对照组大鼠随术后时间延长，STL逐渐延长，提示未经治疗血管性痴呆大鼠学习记忆能力仍随时间延长而有所恢复，推测这可能与侧枝循环逐渐形成及自身的其他代偿机制有关。与对照组相比，6h时丹红组STL有所延长，但无显著性差异，从24h开始丹红组大鼠STL 显著延长。由此可见，丹红注射液可明显延长血管性痴呆大鼠的潜伏期，对学习记忆障碍具有明显改善作用，这种作用从术后24h才开始凸显。海马是与学习记忆有关的重要脑部结构，丹红组各时间点海马CA1区凋亡细胞数目均较对照组显著减少，由此我们推测，丹红注射液对血管性痴呆大鼠学习记忆功能的改善可能与减少海马CA1区细胞凋亡有关。

血管性痴呆的发病机制目前尚未完全阐明，可能的发病机制包括胆碱能神经通路受损、兴奋性氨基酸毒性作用、氧自由基释放、神经元凋亡[9]等。低氧诱导因子-1是一种DNA 结合性蛋白质因子，具有α和β亚基，其中α亚基是调节HIF-1 活性的功能亚单位。脑缺血时，组织局部产生一种转录因子HIF，HIF进入细胞核内，与染色体上缺氧反应元件(Hypoxia response element，HRE)结合，启动包括EPO基因在内的一系列基因的转录，参与了缺血/缺氧后血管生成、血管重塑、能量代谢、血管舒缩反应、细胞凋亡与增殖、红细胞生成等代偿过程，发挥脑保护作用[10-12]。但是HIF持续增多则可使糖酵解加强，线粒体代谢减弱；红细胞增多，血液增稠；血小板增多，血栓易形成等不利影响，加重机体的缺氧。从本实验可看出，6h时丹红组HIF-1α蛋白表达与对照组无明显差异，24h时丹红组表达明显升高，而此后72h开始HIF-1α蛋白表达显著降低，提示丹红注射液可增加早期海马CA1区HIF-1α蛋白的表达，但从72h开始则开始下调这种表达，由此我们推测丹红注射液可能通过早期上调HIF-1α蛋白表达启动脑缺血缺氧后的防御机制，而72h后则下调HIF-1α蛋白表达避免其过度表达所产生的不利影响，从而起到了脑保护作用。

综上所述，丹红注射液可能对血管性痴呆大鼠的学习记忆障碍具有改善作用，其机制可能与调节了HIF-1α蛋白表达，减少了海马CA1区的细胞凋亡有关，但其是如何通过调节HIF-1α蛋白表达从而发挥这一作用的，仍需分子生物水平的进一步研究。本研究为传统中医药丹红注射液的在血管性痴呆治疗中的应用奠定了一定的理论基础。

[1] 金 杰，贾敬选，郭智宽. 丹红注射液治疗血管性痴呆的临床研究及对B- Ap、Apo B的影响[J]. 中医学报，2010，147(25): 271- 273.

[2] 刘 刚.丹红注射液联合尼莫地平治疗血管性痴呆35例[J].中国药业，2012，12(21)：105.

[3] 刘 梅，郑素军，董 蕾，等. 侧脑室注入胃动素对大鼠摄食及学习记忆能力的影响[J ]. 西安交通大学学报，2011，32 (1): 43- 46.

[4] 孙石磊，马光瑜，王鲁华，等. 纳洛酮对血管性痴呆大鼠血浆内皮素的影响[ J] . 陕西医学杂志，2005，34(4): 390-392.

[5] 姜 源. 丹红注射液治疗不稳定型心绞痛38例[J]. 陕西中医，2014,35(11)：1487-1488.

[6] 袁加文，王 枫，孙晓江. 丹红注射液治疗急性缺血性脑卒中的临床研究[J]. 中国老年学杂志，2011，31(1)：41- 42.

[7] 赵培欣，江 珊. 丹红注射液对PCI术后患者ET-1、sP-sel及hs- CRP的影响[J]. 中国中西医结合杂志，2011，31(1)：11- 14.

[8] 王世彬，程丽平，李 冲，等. 丹红注射液对缺血性脑卒中患者血脂水平、NFDS评分、Barthel指数的影响[J].陕西中医，2015,36(4)：390-392.

[9] 黄 玮. 血管性痴呆的发病机制研究进展[J].中国医药指南，2012，10(5): 62-64.

[10] Liu R，Suzuki A，Guo Z，etal. Intrinsic and extrinsic erythropoietin enhances neuroprotection against ischemia and reperfusion injury in vitro[J]. J Neurochem，2006，96 (4):1101-1110

[11] Lin Chen-Huan，Lee Hsu-Tung，Lee Shin-Da，etal. Role of HIF-1α-activated Epac1 on HSC-mediated neuroplasticity in stroke model[J]. Neurobiol Dis，2013，58:76-91.

[12] Sheldon R，Ann Lee，Christina L，etal. Hypoxic preconditioning protection is eliminated in HIF-1α knockout mice subjected to neonatal hypoxia-ischemia [J]. Pediatr Res，2014，76(1)：46-53.

(收稿：2015-07-20)

Protective effects and mechanism of Danhong injection on learning-memory disorder of vascular dementia rats The Second Department of Neurology，People's Hospital of Shaanxi Province

(Xi’an 710068)

Guo Hena Wang Qian Yang Qian

Objective: To observe the effect of Danhong Injection on learning-memory disorder of vascular dementia rats，and to explore its mechanism. Methods: Male SD rats were randomly divided into three groups: sham- operated group，control group and Danhong group. The vascular dementia model was created by a permanent bilateral common carotid arteries occlusion (2-VO) in Sprague-Daewley rats. Rats were evaluated on learning-memory ability by passive avoidance test. At corresponding time points at 6h，24h，72h，1w and 1m，the dynamic changes on the cell counts of HIF-1a and apoptosis in hippocampus CA1 were determined by immunohistochemical method and TUNEL respectively. Results: ①The apoptotic neurons were injured most severely at 72h in control group. While in the Danhong group，the number of neuronal apoptosis significantly decreased at respective time. ②Compared with the rats in control group，the performance on passive avoidance test of rats in Danhong group was improved significantly after 24h. There were no differences at 6h. ③The level of positive expression of HIF-1α in the hippocampal CA1 significantly increased at 24h，but significantly decreased after 72h. Conclusion: Danhong Injection could improve the learning-memory ability of vascular dementia rats. The protective mechanism might be related to the effect of preventing apoptosis in rat hippocampus CA1and regulating expression of HIF-1a.

@Danhong Injection Dementia，vascular/drug therapy Learning memory disorder Rats

*陕西省科学技术研究发展计划项目-社发攻关(2014K11-02-04-14)

@丹红注射液 痴呆，血管性/药物疗法 学习障碍 记忆障碍 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.004