沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖及IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA表达的影响

萨茹丽，木其尔，王翠芳，包玲玲，敖长金*，王思珍

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018； 2.内蒙古民族大学动物科学与技术学院，通辽 028000)

沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖及IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达的影响

萨茹丽1，木其尔1，王翠芳1，包玲玲1，敖长金1*，王思珍2

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018； 2.内蒙古民族大学动物科学与技术学院，通辽 028000)

本试验以绵羊外周血淋巴细胞为研究对象，研究沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖率，IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表达量的影响，为全面揭示沙葱黄酮的免疫调节活性机制和相关产品的开发提供试验依据。试验采用MTT法研究沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖率的影响，使用RT-PCR法研究沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表达量的影响。结果显示，沙葱黄酮具有促进绵羊外周血淋巴细胞增殖的作用，对绵羊外周血淋巴细胞IL-2 mRNA表达无明显调节作用，可上调IFN-γmRNA表达，下调IL-4 mRNA表达。综上，沙葱黄酮具有促进绵羊外周血淋巴细胞增殖及免疫调节活性的作用。

沙葱黄酮；淋巴细胞增殖；IL-2；IL-4；IFN-γ

沙葱又名蒙古韭，主要生长于我国西北部荒漠化草原，是一种抗寒抗旱能力极强的百合科葱属植物[1]。研究表明，沙葱及其提取物在抗氧化[2-3]、抗菌及提高畜产品品质[4-5]、改善家畜免疫机能[6-7]等方面具有较好的生物功效。沙葱黄酮(AlliumMongolicumRegelFlavonoids，AMF)是由沙葱嫩叶中分离得到的一种天然植物提取物[8]。赵春艳等研究表明，沙葱黄酮具有较好的抗氧化活性[9]及免疫调节活性[10]。

本试验欲通过体外试验观察沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖率的影响，并使用实时荧光定量PCR方法测定沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达的影响，旨在为沙葱黄酮类化合物的深入研究与相关产品的开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

沙葱黄酮参照文献[6]报道的方法由本实验室自制。

羊外周血淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司生产；胎牛血清、RPMI-1640为Gibico公司生产；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、β-巯基乙醇、刀豆蛋白A(ConA)等均为Sigma公司产品；磷酸盐缓冲液(PBS)为Hyclone 公司生产；RNA iso plus(D9108B)、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(DRR820A)、Prime Script@RT Master Mix Perfect Real Time (DRR036S)、DL2000 DNA Marker(D501A)、DL500 DNA Marker(D525A)、pMD 19-T Vector(D102A)等均购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 主要仪器

HEPA class 100 CO2培养箱；BIOTEK Synergy H4型全自动多功能酶标仪；ESCO AC2-4S1生物安全柜；Olympus IX71倒置相差显微镜；Nikon YS100普通光学显微镜公司；Bio-Rad iQ5 Multicolor 荧光定量PCR仪；TGRADIENT梯度PCR仪等。

1.3 试验方法

1.3.1 绵羊外周血淋巴细胞的分离及培养 参照文献[11]的方法，无菌采集健康蒙古绵羊颈静脉血，血液采用肝素钠抗凝。1 500 r·min-1离心10 min后去除血清，将血浆与PBS等比例混匀，取5 mL缓慢铺在分装于玻璃离心管的羊淋巴细胞分离液(4 mL)上，3 000 r·min-1离心40 min，中间白色雾状层即为绵羊外周血单个核细胞(PBMC)层，取PBMC用PBS洗涤两次，加入含10% FBS的RPMI-1640细胞培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养4 h，收集未贴壁细胞并重悬于RPMI-1640细胞培养液中，即得到绵羊外周血淋巴细胞。经台盼蓝染色，确定细胞存活率>95%后，调整细胞浓度至1×107个·mL-1，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，用于后续试验。

1.3.2 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖率的影响 试验分为对照组和试验组，对照组为50 μL绵羊外周血淋巴细胞悬液加入50 μL细胞培养液；试验组分为高、中、低计量组，分别为50 μL绵羊外周血淋巴细胞悬液加入50 μL含不同浓度沙葱黄酮的细胞培养液(10 mg沙葱黄酮溶于10 mL RPMI-1640中，0.22 μm滤器过滤除菌后分别稀释至200、100、50 μg·mL-1)于96孔U型细胞培养板中，每个处理5个重复，37 ℃、5% CO2条件下分别培养6、12、24、48 h。培养结束前4 h，每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，培养结束后用平板离心机2 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡摇匀后570 nm处测定各孔吸光度值。

1.3.3 沙葱总黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达的影响

1.3.3.1 试验分组与细胞处理：试验分为对照组与试验组，对照组为1 mL绵羊外周血淋巴细胞悬液加入1 mL细胞培养液；试验组分为高、中、低剂量组，分别为1 mL绵羊外周血淋巴细胞悬液加入1 mL不同浓度沙葱黄酮的细胞培养液(10 mg沙葱黄酮溶于10 mL RPMI-1640中，0.22 μm滤器过滤除菌后分别稀释至200、100、50 μg·mL-1)。按试验分组要求将各组细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔2 mL，每个处理5个重复，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后将细胞转入无菌离心管中，1 500 r·min-1离心10 min，收集沉淀。在所得细胞沉淀中加入4 mL PBS反复吹打混匀后1 500 r·min-1离心10 min，去掉上清，收集沉淀(此步骤重复2～3次)。

1.3.3.2 总RNA的提取：按照RNA提取试剂盒操作说明书进行总RNA提取。提取所得细胞总RNA样品使用Synergy H4多功能酶标仪测定其 A260 nm/A280 nm值，选择A260 nm/A280 nm值为1.8～2.2的样品进行后续试验或冻存于-80 ℃冰箱内备用。

1.3.3.3 反转录反应：按照反转录试剂盒说明书并结合赵飞艳等[12]报道方法进行。

1.3.3.4 引物合成：β-actin、IL-2、IL-4、IFN-γ基因引物序列同赵飞艳等[12]所报道引物序列一致，由大连宝生物公司合成(表1)。

1.3.3.5 实时荧光定量PCR反应：用iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System对绵羊外周血淋巴细胞的cDNA进行荧光定量PCR反应，反应液的组分与配制见表2。β-actin、IL-2、IL-4与IFN-γ基因的反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

表1 引物序列及产物长度

Table 1 Primers sequence and product size

引物名称Primername引物序列(5'-3')Primersequence产物大小/bpProductsizeβ-actinforwardβ-actinreverseIL-2forwardIL-2reverseIL-4forwardIL-4reverseIFN-γforwardIFN-γreverseCCCATTGAGCACGGCATTGCAGGGGTGTTGAAGGTCTCTGTCTTGCATTGCACTAACTCTTGTTCTTTCATTGTGTTCCCCGTAGAATTGAGCTTAGGCGTATCTACAGGTACTCGTCTTGGCTTCATTCACAAATCTAACCTCAGAAAGCGGAAGAGCAGGCAGGAGAACCATTAC1858012281

表2 实时荧光定量PCR的反应液的组分与配制

Table 2 The component of quantitative PCR reaction solution

试剂Reagents使用量/μLUsageamountSYBRPremixEXTaqTMⅡ(2×)12.5PCRForwardPrimer(10μmol·L-1)1.0PCRReversePrimer(10μmol·L-1)1.0cDNA2.0ddH2O8.5Total25.0

1.3.3.6 基因 mRNA 表达水平相对定量与分析：本试验采用比较阈值法对目的基因进行相对定量分析[13]。反应结束后系统自动将荧光信号强度转化为基因的Ct值，统计时对每个基因的3个重复取平均值记为Ct 值。目的基因的相对表达量可以根据公式进行计算：2-ΔΔCt=2-[(试验组目的基因Ct-试验组管家基因Ct)-(对照组目的基因Ct-对照组管家基因Ct)]

其中，2-△△Ct表示目的基因的相对mRNA 表达量。将对照组的2-△△Ct值设为1，各试验组数据同对照组进行比较定量分析。

1.4 数据处理与统计分析

2 结 果

2.1 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖率的影响

表3所示，随着沙葱黄酮浓度的增加各试验组与对照组相比，淋巴细胞增殖率呈逐渐上升后趋于平稳的趋势。当培养时间为6h时各试验组淋巴细胞增殖率显著高于对照组(P<0.01)，同时高、中剂量组淋巴细胞增殖率显著高于低剂量组(P<0.01)；当培养时间由6h延长至12h时各试验组淋巴细胞增殖率显著上升(P<0.01)。当培养时间由12h继续延长至24h时，低剂量组淋巴细胞增殖率显著降低(P<0.01)，中剂量组与高剂量组淋巴细胞增殖率无显著变化(P>0.05)。当培养时间继续延长至48h时，各组淋巴细胞增殖率与24h时淋巴细胞增殖率无显著改变(P>0.05)。由此可知，沙葱黄酮具有促进绵羊外周血淋巴细胞增殖的作用，且混合培养时间为12h时此作用最为明显，后随着时间的延长无显著变化；并且可以看出中剂量沙葱黄酮即浓度为100μg·mL-1时促进淋巴细胞增殖的作用最好。

2.2 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达的影响

2.2.1 绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4、IFN-γ及β-actin荧光定量PCR扩增曲线和熔解曲线 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞中各基因影响的实时荧光定量PCR反应扩增曲线和熔解曲线见图1～3，图中a为基因扩增曲线，b为基因熔解曲线，其中A为目的基因，B为内参基因β-actin。由图可知，各基因扩增情况良好，扩增曲线平滑，呈现典型的S型，熔解曲线为单一峰型，并且峰型比较锐利，说明各扩增的目的基因片段长度一致，不含引物二聚体及其他双链DNA污染，可用于相对定量分析。

表3 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖率的影响

Table 3 The effects of AMF on proliferation of lymphocytes in sheep

组别Group6h12h24h48h对照组Control0.284±0.019aA0.305±0.035bA0.302±0.035aA0.301±0.048bA低剂量组(50μg·mL-1)Lowdose0.328±0.016aB0.361±0.037cB0.354±0.034bB0.352±0.012bB中剂量组(100μg·mL-1)Moderatedose0.350±0.004aC0.386±0.021bD0.381±0.037bC0.385±0.023bD高剂量组(200μg·mL-1)Highdose0.352±0.071aC0.372±0.011bC0.377±0.078bC0.374±0.035bC

同行数据后肩注小写字母不同表示数据差异极显著(P<0.01)，同列数据后肩注大写字母不同表示数据差异极显著(P<0.01)

The different lower case letters in the same row indicate significant difference(P<0.01)，the different uppercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.01)

图1 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2基因qPCR反应扩增曲线(a)和熔解曲线(b)Fig.1 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-2 gene

图2 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-4基因qPCR反应扩增曲线(a)和熔解曲线(b)Fig.2 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-4 gene

图3 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IFN-γ基因qPCR反应扩增曲线(a)和熔解曲线(b)Fig.3 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IFN-γ gene

2.2.2 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达的影响 由表4可知各剂量组沙葱黄酮对IL-2 mRNA的表达无显著影响；各试验组IL-4 mRNA的表达量均极显著低于对照组(P<0.01)，且各浓度组间比较差异均为极显著(P<0.01)。说明沙葱黄酮具有下调绵羊外周血淋巴细胞IL-4 mRNA表达的作用，且这种下调作用与浓度呈正相关。比较各试验组对IFN-γmRNA表达的结果可知，各浓度沙葱黄酮均可上调IFN-γmRNA的基因表达，与对照组比较差异极显著(P<0.01)，高剂量组与中、低剂量组比较差异极显著(P<0.01)，中剂量组与低剂量组比较有升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。说明沙葱黄酮对IFN-γmRNA表达有显著的促进作用，且这种促进作用与剂量呈正相关。

表4 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达的影响

Table 4 Effects of the AMF on sheep peripheral blood lymphocyte’sIL-2，IL-4 andIFN-γmRNA expression

组别GroupIL-2IL-4IFN-γ对照组Control11a1a低剂量组(50μg·mL-1)0.994±0.0150.752±0.044b2.237±0.045b中剂量组(100μg·mL-1)1.087±0.0130.554±0.003c2.484±0.021bc高剂量组(200μg·mL-1)1.100±0.0030.144±0.005d3.394±0.174d

同列数据肩注小写字母不同表示数据差异极显著(P<0.01)

The different lower case letters indicate significant difference(P<0.01)

3 讨 论

3.1 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞增殖率的影响作用

淋巴细胞增殖能力是反应机体细胞免疫水平的重要指标之一[14]，且淋巴细胞的增殖状态与机体细胞免疫状态成正相关[15]。淋巴细胞增殖试验因其所需时间较短、试验条件稳定等优势已经成为免疫增强药物的初步筛选、活性强弱评定以及作用机理研究的首选方法[16]。诸多研究报道显示，黄酮类化合物具有促进淋巴细胞增殖的活性，如杨秀松等研究报道金花葵粗黄酮具有一定的免疫调节作用，可有效促进小鼠淋巴细胞增殖、增加单核细胞吞噬指数[17]。徐璐等研究报道表明，黄芪总黄酮能显著增强小鼠的免疫功能，可显著提高小鼠单核巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素水平，促进小鼠脾淋巴细胞增殖，抑制小鼠迟发型超敏反应[18]。辛欢欢等研究白花蛇舌草黄酮注射液对小鼠淋巴细胞的免疫调节活性时发现，在适当的浓度范围内白花蛇舌草黄酮可以有效促进小鼠脾淋巴细胞增殖、细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的分泌[19]。除此之外大量研究表明，沙葱及其提取物可促进机体免疫机能，沙葱多糖可以显著提高绵羊外周血淋巴细胞增殖、具有明显的免疫调节活性[19]。本试验结果显示，随着沙葱黄酮浓度的增加与共同培养时间的延长，淋巴细胞增殖率呈逐渐上升后趋于平稳的趋势，表明沙葱黄酮具有促进绵羊外周血淋巴细胞增殖的作用，且混合培养时间为12 h时、添加剂量为100 μg·mL-1时促进淋巴细胞增殖的作用较好。这可能是因为沙葱黄酮中含有3′，4′-环氧基-7-O-5-甲氧基黄酮醇与7-O-5，4′-二甲氧基-3′-羟基黄酮等黄酮类物质[20]，这些黄酮类化合物的基本结构与雌激素类同，参与机体免疫调节。除此之外沙葱黄酮分子结构中C2=C3双键也是沙葱黄酮具有免疫调节活性的原因之一[20]。

3.2 沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达的影响

细胞因子是指生物机体在炎症与免疫应答过程中产生的一系列具有免疫调节活性的小分子多肽或蛋白质，而这些细胞因子均由其特定的免疫细胞表达分泌[21]。当机体受到外来因素如病毒、细菌或其他病原微生物的侵害时机体会启动其天然免疫和特异性免疫效应机制，而细胞因子就是介导这些效应机制的分子。T细胞分泌和转录的细胞因子是特异性免疫应答的激活阶段，而IL-2、IL-4和IFN-γ等是启动免疫应答的关键因子，其中，IL-2主要来源于T细胞以及T细胞系，具有诱导T细胞产生多种淋巴因子，促进B细胞和杀伤性NK细胞的增殖与分化，促进抗体合成等生物功效[22]。IL-4主要来源于CD4+T细胞，具有促进T细胞生长、B细胞分化以及参与单核吞噬细胞的活化与抑制作用。IFN-γ也称为免疫干扰素，具有直接促进T、B细胞分化，激活NK细胞，增强TNF对内皮细胞的作用，还具有增强细胞核体液免疫应答，激活巨噬细胞、促进巨噬细胞的吞噬能力除去病原微生物与癌变细胞等作用。黄酮类化合物作为植物天然有效成分具有较强的免疫调节作用，且其免疫调节活性已经成为黄酮类化合物研究的热点问题。唐浩国等研究报道，竹叶黄酮在0～80 μg·mL-1可显著提高小鼠脾细胞的细胞增殖率并且促进脾细胞IFN-γ基因mRNA表达，促进T和B淋巴细胞的增殖与分化，显著增强小鼠免疫调节作用[23]。徐波等研究报道称地锦草总黄酮可有效提高机体免疫机能，并有效促进免疫相关细胞因子IL-2、IFN-γ等基因的mRNA表达[24]。朱兆荣等研究报道，复方苦芩可有效增强小鼠非特异性免疫功能，同时能够降低犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA表达，升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA表达[25]。杨晓航等研究报道，黄芪总黄酮具有调节佐剂性关节炎模型大鼠外周血细胞因子表达水平的作用[26]。基于本试验研究结果认为，沙葱黄酮对绵羊外周血淋巴细胞具有一定的免疫调节活性。这种生物活性可能与其独特的生物分子结构有关，其所含的3′，4′-环氧基-7-O-5-甲氧基黄酮醇与7-O-5，4′-二甲氧基-3′-羟基黄酮等黄酮类化合物分子结构中C2=C3结构和类雌激素结构等均是免疫增强结构基团，这些基团作用于淋巴细胞后，通过上调绵羊外周血淋巴细胞中IFN-γmRNA的表达，下调IL-4 mRNA的表达起到有一定的体外免疫调节作用，但其具体分子信号通路以及作用机制还有待于进一步研究证实。

4 结 论

基于上述研究结果，推测沙葱黄酮发挥免疫调节作用的部分机制：通过促进绵羊外周血淋巴细胞增殖，上调IFN-γmRNA表达，下调IL-4 mRNA表达，进而实现其对绵羊的免疫调节活性。

[1] 敖长金.沙葱化学成分及其生物学功能研究进展[J].饲料工业，2010，(18)：5-9. AO C J.Recent advances in chemical iingredients and biological function ofAlliumMongolicumRegel[J].FeedIndustry，2010，(18)：5-9.(in Chinese)

[2] 萨茹丽，杨 斌，敖长金.沙葱有效提取物对肉仔鸡免疫机能影响的研究[J].饲料工业，2009，30(10)：28-41. SA R L ，YANG B，AO C J.Effect ofAlliummongolicumRegelextracts on the immune fuction for broilers[J].FeedIndustry，2009，30(10)：28-41.(in Chinese)[3] 宋巴达玛.沙葱多糖对肉羊免疫机能和抗氧化作用的影响[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2010：5-7. SONG B D M.Study on the effect of polysaccharide fromAlliumMongolicumRegelon immune function and antioxidation in meat sheep[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2010：5-7.(in Chinese)

[4] 乌仁张嘎.沙葱挥发油的提取，成分鉴定及其体外抑菌效果的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2011：18-20. WU R Z G.Studies on extracting process，chemical constituents and antibacterial effects of essential oils fromAlliumMongolicumRegel[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2011：18-20.(in Chinese)

[5] 扈瑞平.沙葱多糖的分离、纯化和结构鉴定及其生物学活性的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2010：4-5. HU R P.Studies on separation，purification，structural identification and biological activity ofAlliumMongoliumRegelpolysaccharides[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2010：4-5.(in Chinese)

[6] 赵春艳.沙葱中总黄酮的分离纯化、结构鉴定及其对机体免疫抗氧化机能影响的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2008：10-28. ZHAO C Y.Studies on separation，purification and structural characterizations of flavonoids from Allium mongolia Regel and its effects on immunity and antioxidant function in body[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2008：10-28.(in Chinese)

[7] 王丽思，敖长金，张兴夫.沙葱多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的激活作用[J].中国畜牧兽医，2010，37(4)：50-52. WANG L S，AO C J，ZHANG X F.Activation of peritoneal macrophages by polysaccharides extracted fromAlliumMongolicumRegelin mice[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2010，37(4)：50-52.(in Chinese)

[8] 赵春艳，敖长金，缪亚娟，等.沙葱中黄酮类化合物分离提取工艺的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2010，(1)：131-133. ZHAO C Y，AO C J，MIAO Y J.Extraction of flavonoids fromAlliumMongolicumRegel[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine，2010，(1)：131-133.(in Chinese)

[9] 赵春艳，敖长金，缪亚娟，等.沙葱黄酮对小鼠抗氧化能力的影响[J].饲料工业，2009，30(24)：10-13. ZHAO C Y，AO C J，MIAO Y J.Effect of flavone inAlliumon antioxidant capacity for mouse[J].FeedIndustry，2009，30(24)：10-13.

[10] 赵春艳，敖长金，张兴夫.沙葱中黄酮类化合物对小鼠非特异性免疫机能影响的研究[J].饲料工业，2010，31(18)：11-14. ZHAO C Y，AO C J，ZHANG X F.Studies on flavonoids fromAlliumMongolicumRegeleffects to non-specific immunity function in mice[J].FeedIndustry，2010，31(18)：11-14.(in Chinese)

[11] 包美艳，敖长金，赵飞艳，等.沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞的调节作用研究[J].饲料工业，2013，34(12)：9-12. BAO M Y，AO C J，ZHAO F Y，et al.Study on the reguleting effect ofAlliumMongolicumRegelpolysaccharides on peripheral blood lymphocytes of sheep[J].FeedIndustry，2013，34(12)：9-12.(in Chinese)

[12] 赵飞艳，敖长金，包美艳，等.沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞IFN-γ与STAT1 mRNA表达的影响[J].畜牧兽医学报，2013，44(12)：1932-1938. ZHAO F Y，AO C J，BAO M Y，et al.Effect ofAlliumMongolicumRegelpolysaccharides on IFN-γ and STAT1 mRNA expression in peripheral blood[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(12)：1932-1938.(in Chinese)

[13] STEPHENSON F H.Calculations for molecular biology and biotechnology：A guide to mathematics in the laboratory 2e[M].Academic Press，2010.

[14] KIM H M，HANS B，OH G T，et al.Stimulation of humoral and cell mediated immunity by polysaccha-ride from mushroom Phellinus Linteus[J].IntJImmunopharmacol，1996，18(5)：295-303.

[15] 高 焕，王德云，郭利伟，等.淫羊藿多糖脂质体对鸡淋巴细胞增殖及 IL-2、IL-4 和 IFN-γ mRNA 表达的影响[J].畜牧兽医学报，2013，44(1)：115-121. GAO H，WANG D Y，GUO L W，et al.Effect of epimedium polysaccharide liposome on lymphocyte proliferation，mRNA expression of IL-2，IL-4 and IFN-γ in chicken[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(1)：115-121.(in Chinese)

[16] 贺新怀.中医药免疫学巨[M].北京：人民军医出版社，2002：408. HE X H.Chinese medical immunology[M].Beijing：People's Military Medical Press，2002：408.

[17] 杨秀松.金花葵粗黄酮提取物的免疫调节作用研究[J].中国药师，2013，(9)：1307-1311. YANG X S.Immunoregulation of crude flavonoids fromAbelmoschusManihotFlower[J].ChinaPharmacist，2013，(9)：1307-1311.(in Chinese)

[18] 徐 璐，李艳明，刘婧陶，等.黄芪总黄酮对小鼠免疫功能的影响[J].动物医学进展，2013，34(11)：36-39. XU L，LI Y M，LIU J T.Effects of total flavones of astragalus on immune function in mice[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2013，34(11)：36-39.(in Chinese)

[19] 辛欢欢，李春玲，王贵平.白花蛇舌草黄酮注射液对小鼠脾淋巴细胞的免疫增强作用[J].中国兽医科学，2010，40(7)：752-757. XIN H H，LI C L，WANG G P.Immunological enhancement of flavones of oldenlandia diffusa wild injection on mouse splenic lymphocytes[J].ChineseVeterinaryScience， 2010，40(7)：752-757.(in Chinese)

[20] 萨茹丽.沙葱黄酮提取工艺优化、结构鉴定及其相关生物活性研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2014：100-101. SA R L.Studies on extraction process，structural identification and related biological activity ofAlliumMongolicumRegelflavonoids[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2014：100-101.(in Chinese)

[21] FIORENIIONO D F，BOND M V，MOSMANN T R.Two type of mouse T helper cell .1V.Th2clones secrete a factor that inhibitors cytokine produetion by Thl elones[J].JExpMed，1989，170(6)：2081-2095.

[22] PEDERSEN S F，KRAMBOFT B，JORGENSEN N K，et al.Shrinkage-induced aetivation of the Na+/H+exehange in Ehrllch aseites tumor cells：mechanisms involved in the activation and a role for the exchanger in cells volume regulation[J].JMemborBiol，1996，149(5)：141-159.

[23] 唐浩国，魏晓霞，李 叶，等.竹叶黄酮对小鼠脾细胞免疫的分子机制研究[J].食品科学，2007，28(9)：523-526. TANG H G，WEI X X，LI Y，et al.Study on molecule mechanism of immunoregulation to spleen cells of rat with flavonoids from bamboo leaves[J].FoodScience，2007，28(9)：523-526.(in Chinese)

[24] 徐 波，张建超，付作明，等.地锦草总黄酮对小鼠免疫功能及细胞因子 mRNA 表达影响[J].中兽医医药杂志，2010 (5)：22-26. XU B，ZHANG J C，FU Z M，et al.Effects of euphorbiae humifusae total flavonoids on immunity and mRNA expression of some cytokines in mice[J].JournalofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，2010，(5)：22-26.(in Chinese)

[25] 朱兆荣，刘 娟，杜林林，等.复方苦芩对小鼠免疫功能及犬 IL-4 mRNA 和 IFN-γ mRNA 表达的影响[J].中国兽医科学，2012，42(8)：875-880. ZHU Z R，LIU J，DU L L，et al.Effect of Kuqin compound on immune function of experimental animals and on expressions of canine IL-4 mRNA and IFN-γ mRNA [J].ChineseVeterinaryScience，2012，42(8)：875-880.(in Chinese)

[26] 杨晓航，史传道，叶峥嵘，等.黄芪总黄酮对佐剂性关节炎模型大鼠 IL-4、IFN-γmRNA 表达影响的研究[J].陕西医学杂志，2010，(8)：944-946. YANG X H，SHI C D，YE Z R，et al.Effect of TFA on expression of IL-4 mRNA and IFN-γ mRNA in adjuvant arthritis in rats model[J].ShaanxiMedicalJournal，2010，(8)：944-946.(in Chinese)

(编辑 郭云雁)

Effect ofAlliumMongolicumRegelFlavonoidson Lymphocyte Proliferation，mRNA Expression ofIL-2，IL-4，IFN-γin Peripheral Blood Lymphocyte of Sheep

SA Ru-li1，MU Qi-er1，WANG Cui-fang1，BAO Ling-ling1，AO Chang-jin1*，WANG Si-zhen2

(1.CollegeofAnimalScience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，InnerMongoliaUniversityfortheNationalities，Tongliao028000，China)

In order to study the action mechanism ofAlliumMongolicumRegelFlavonoids(AMF) on immunological enhancement activity，the effects of AMF on lymphocyte proliferation and mRNA expression ofIL-2，IL-4 andIFN-γwere determined by MTT method and real-time fluorescent quantitation PCR assay.The peripheral blood lymphocyte of sheep was used in this study.The results showed that AMF could significantly enhance lymphocyte proliferation.AMF could significantly up-regulate mRNA expression ofIFN-γ，down-regulate mRNA expression ofIL-4，and have no significantly effect onIL-2 mRNA expression.The result indicate that AMF has immunoregulatory activity and could enhance lymphocyte proliferation.

AlliumMongolicumRegelFlavonoids；lymphocyte proliferation；IL-2；IL-4；IFN-γ

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.024

2014-09-05

国家自然科学基金地区科学基金项目(31260558；31160474)；“十二五”国家科技支撑计划(2013BAD10B04)

萨茹丽(1986-)，女，内蒙古自治区兴安盟人，博士生，主要从事动物营养与畜产品品质研究，E-mail：qisaruli@126.com

*通信作者：敖长金，教授，博士生导师，主要从事动物营养与饲料科学研究，E-mail：changjinao@aliyun.com

S826；S813.3

A

0366-6964(2015)06-1063-08