转基因抗除草剂油菜杂种优势利用系统研究Ⅰ.转基因雄性不育系15A选育

陈社员，官春云，刘忠松，官 梅，邬贤梦，谭太龙，张振乾，肖 钢，陈 浩，杨 倩

(湖南农业大学，长沙 410128)

转基因抗除草剂油菜杂种优势利用系统研究Ⅰ.转基因雄性不育系15A选育

陈社员，官春云，刘忠松，官 梅，邬贤梦，谭太龙，张振乾，肖 钢，陈 浩，杨 倩

(湖南农业大学，长沙 410128)

利用转基因技术将不育基因barnase导入到甘蓝油菜湘油15号中，通过多代回交选育，获得遗传稳定的转基因雄性不育系15A。该不育系不育彻底且不受温度变化影响，除不育性状外，其他性状与湘油15号无明显差异。

油菜；雄性不育系；转基因；育种

植物雄性不育及恢复的机理通过分子生物学的深入研究得以破解。现今，科学家已能利用基因工程技术获得完全不同于传统的全新植物雄性不育杂种优势利用系统[1]。1990年，Mariani等利用TA29启动子和核糖核酸水解酶基因barnase构建了在花药绒毡层特异表达的不育嵌合基因[2]，同时，利用TA29启动子和该基因的抑制蛋白基因barstar构建恢复嵌合基因[3，4]，以抗草丁膦除草剂的bar基因作筛选标志，经农杆菌转化获得了转基因油菜雄性不育和恢复植株。此后，该不育和恢复基因被导入多种植物中[2，5～10]，但发现转入不育基因的不育植株在较高温度时育性变化很大，有些不育植株甚至在高温时育性恢复，因此这些材料很难得到实际利用。为克服这一现象，李文彬等将TA29与35S启动子和类黄酮合成酶基因启动子中的antherbox序列串联，以提高TA29的起动效率，调节35S启动子在花药中的特异表达，设计出了antherbox- CaMV35S-TA29，再与barnase基因融合构建成不育基因，将其导入拟南芥中，获得了稳定的雄性不育植株[11]。目前，国内此类研究多局限于导入基因转化植株的基础研究，没有育成作物转基因雄性不育系和恢复系的报道，而PGS(Plant Genetic System)公司已成功实现该系统杂交油菜在加拿大的大规模商业化生产应用[12]。湖南农业大学利用李文彬等提供的利用TA29-barnase构建的嵌合基因质粒pBI-TBS-bar及根癌农杆菌(Agrobacteriumturmefaciens)LBA4404，通过农杆菌介导方法转化甘蓝型油菜优良品种湘油15号，获得了转基因雄性不育植株[13]。经多年选择，育成了性状稳定的抗灭生性除草剂草胺丁膦(PPT)的基因工程油菜雄性不育系15A，同时对其结实特性[14]、生化特性[15]、菌核病抗性[16]等进行了研究。本文主要介绍该不育系的选育过程及特征特性。

1 15A的选育过程

2000年，将李文彬等提供的含有不育基因的TA29-barnase嵌合基因质粒pBI-TBS-bar及根癌农杆菌(Agrobacteriumturmefaciens)LBA4404，利用农杆菌介导法转化湘油15号，获得转基因抗灭生性除草剂草胺膦(PPT)雄性不育株，表现为雄蕊退化、花药褐黄空瘪、无花粉。不育株再用湘油15号回交，回交后代选生长正常、不育性性状好的植株不断与湘油15号回交，至2003年获得除不育性状外，其他性状与湘油15号基本一致的转基因不育材料15A。2003年经国家转基因办批准，对该材料进行了3年的中间试验，2006年又进行了第2个2年中间试验。以后该不育材料经不断回交保持、选择，形成了稳定的基因工程不育系15A。

2 15A不育特性

2.1 15A田间不育株比例

多年观察发现，15A田间不育株与可育株分离比例完全符合1∶1比例(表1)，与通常的隐性核不育系田间不育株比例完全相同。若在苗期喷施1% PPT，死亡的植株数与存活的植株比例为1∶1。存活的植株在花期调查，除2%左右的植株可育外，其余均为不育株，说明存活的不育植株带有不育基因barnase和抗PPT的bar基因，同时说明15A中导入的barnase-bar基因为单考贝，而可被PPT杀死的植株体内不带有barnase-bar基因(图1，封三)。

表1 15A田间育性分离情况

2.2 15A花器形态

15A的花器外观与一般油菜没有明显区别，比原始亲本湘油15号的花稍小(表2)，雄蕊在开花初期完全退化(图2， 封三)，到开花中后期则出现未完全退化的雄蕊，雌蕊完全正常，柱头不弯曲，蜜腺正常(图3，封三)。

表2 转基因油菜与非转基因油菜花器形态比较(mm，2005)

2.3 15A花粉活力检测

15A整个花期外观看不到花粉，取花药压碎用甲烯蓝染色，中后期有极小量的可染成蓝色的败育花粉粒(图4，封三)。

2.4 15A田间结果能力

同等条件下种植，比较15A和湘油15号的植株花蕾数、总花数、总果数、结果率及种子颜色，两者没有明显差异(表3)。

表3 15A和湘油15号结果能力比较(2004～2006)

花期对15A进行多年自交套袋观察，在215个套袋单株(约20多万朵花)中，没有发现一粒自交结实的种子(图5，封三)，说明15A整个花期均完全不育。但其异交结实与一般油菜没有区别：无论是人工授粉套袋，还是自然授粉，其结果均完全正常。

3 15A主要特征特性

3.1 生育期

15A的出苗期、终花期、成熟期等各生育阶段以及全生育期与原始亲本湘油15号无明显差异，说明导入基因后经多代回交，没有引起生育期明显变化(表4)。

表4 15A与湘油15号生育期比较

3.2 5叶期叶片性状

5叶期，转基因油菜15A与其原始亲本植株比，植株的叶形、叶毛、叶缺及叶片大小等没有明显差异，说明导入基因没有影响植株的基本性状。在叶色方面，5叶期前，15A叶色比原始亲本稍绿，叶绿素含量稍高(表5)。

表5 15A与湘油15号5叶期叶片性状比较 (2005-11-08)

3.3 越冬期叶片性状

越冬期观察，15A和其原始亲本植株叶片主要性状没有明显区别(表6)，说明外源基因的导入没有引起油菜越冬期植株性状发生明显变化(表6)。

表6 15A与湘油15号越冬期植株性状(2005-12-25)

3.4 成熟期主要经济性状

成熟期15A及原始亲本湘油15号的株高、一次有效分枝数、二次有效分枝数、单株角果数、每果粒数、千粒重等农艺性状没有明显差异(表7)。

表7 15A与湘油15号农艺性状比较(2005-05-06)

3.5 品质性状

对15A与原始亲本的种子含油量、芥酸和硫苷含量进行检测，两者品质性状没有明显差异。

表8 15A与湘油15号品质性状比较(2006)

4 讨论

(1)15A是将不育基因barnase导入优质油菜湘油15号中，再用湘油15号不断回交保持育成的不育系，其主要特征特性除不育性状外，其他性状基本与原始亲本湘油15号相同。

(2)15A的不育特性只能由含有barstar恢复基因的油菜恢复，不含该基因的油菜均是该不育系的保持系。

(3)15A田间喷施PPT后有极少量的可育株(2%左右)，这些植株带有bar基因，但为什么可育尚需进一步研究。

[1] 官春云，李 栒，李文彬.芸薹属植物的生物工程[M].长沙：湖南科学技术出版社，1999.

[2] 李胜国，刘玉乐，康良仪，等.烟草花药特异启动子的克隆、活性测定及雄性不育基因的构建[J].农业生物技术学报，1995，3(3)：25-32.

[3] Mariani C，De Deuckeleer M，Truettner J.Induction of male sterility in plants by a chimaericRibonucleasegene[J].Nature，1990，347(25)：737-741.

[4] Mariani C，Gossele V，De Deuckeleer M.A chimaeric ribonuclease-inhibitor gene restorer feterlity to male-sterility plants[J].Nature，1992，357(4)：384-387.

[5] 曹光诚，孙如勇，陈占宽，等.人工雄性不育基因和恢复基因的克隆及构建研究[J].中国农业科学，1996，29(3)：20-26.

[6] 彭仁旺，周雪荣，周奕华，等.烟草花药特异表达启动子的克隆和序列分析[J].生物工程学报，1996，12：247-250.

[7] 彭仁旺，周雪荣，王峻岭，等.表达Barstar基因及bar基因的转基因油菜的研究[J].遗传学报，1998，25(1)：74-79.

[8] 李胜国，刘玉乐，朱 锋，等.基因工程雄性不育烟草及其温度敏感性[J].植物学报，1997，39(3)：231-235.

[9] 陈 潜，汪迎春，张利明，等.花药特异嵌合启动子的构建及雄性不育转基因拟南芥的获得[J].农业生物技术学报，2001，9(1)：62-64.

[10] 陈银华，张广平.雄性不育基因barnase对西瓜的遗传转化[J].湖南农业大学学报(自然科学版)，2006，32(4)：128-130.

[11]李文彬，汪迎春，张利明，等.芽孢杆菌核糖核酸酶基因植物花药特异性表达载体[P].中国专利：CN 1234447，1999-11-10.

[12]张云珍.加拿大转基因油菜商业化进展及现状分析[J].世界农业，2011(10)：74-76.

[13]何业华，熊兴华，官春云，等.根癌农杆菌介导TA29-barnase基因转化甘蓝型油菜的研究[J].作物学报，2003，29(4)：615-620.

[14]龚 莉，王国槐，官春云，等.转基因油菜雄性不育系15A生化特性研究[J].作物研究，2005，19(3)：185-188.

[15]王国槐，龚 莉，官春云，等.转基因油菜雄性不育系15A结实性研究[J].种子，2006，25 (1)：54-55.

[16]龚 莉，王国槐，官春云，等.转基因油菜雄性不育系15A及恢复系菌核病抗性研究[J].安庆师范学院学报，2008，14 (2)：57-59.

A Transgenic Herbicide-resistant System for Utilization of Heterosis in Rapeseed (Brassicanapus)Ⅰ.Breeding of A Transgenic Male-sterile Line 15A

CHEN She-yuan，GUAN Chun-yun，LIU Zhong-song，GUAN Mei，WU Xian-meng， TAN Tai-long，ZHANG Zheng-qian，XIAO Gang，CHEN Hao，YANG Qian

(Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

The successive backcrossing was used to develop a transgenic male-sterile line 15A after introduction of the male-sterility-causing genebarnaseinto the cultivar Xiangyou 15 by genetic transformation.This male-sterile line showed a complete male sterility，with no influence of temperature fluctuation on its fertility.For agronomical characters，the male-sterile line is comparable to its receptor parent Xiangyou 15.

rapeseed; male-sterile line; transgenesis；breeding

2015-01-06

陈社员(1956-)，男，湖南祁东县人，研究员，主要从事油菜育种工作。

南方粮油作物协同创新中心项目(2012AA101107；2011AA10A10406)。

S565.4035.3

A

1001-5280(2015)02-0128-04

10.3969/j.issn.1001-5280.2015.02.04