拟目乌贼生殖腺多糖提取工艺优化及自由基清除能力研究

戴宏杰,孙玉林,郑小林,陈道海,*

(1.岭南师范学院生命科学与技术学院,广东湛江524048;2.浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江杭州 310018



拟目乌贼生殖腺多糖提取工艺优化及自由基清除能力研究

戴宏杰1,2,孙玉林1,郑小林2,*,陈道海1,*

(1.岭南师范学院生命科学与技术学院,广东湛江524048;2.浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江杭州 310018

以拟目乌贼生殖腺为材料,在对料液比、提取时间及提取温度进行单因素实验的基础上,采用Box-Benhken实验设计优化热水浸提法提取多糖工艺,并通过清除超氧阴离子和羟基自由基的能力探究其体外抗氧化活性。结果表明:拟目乌贼生殖腺多糖热水浸提法最佳提取工艺条件为料液比1∶30g/mL,提取温度 90℃,提取时间1h,在此条件下拟目乌贼生殖腺多糖得率为0.751%;拟目乌贼生殖腺多糖对超氧阴离子自由基和羟自由基均有一定的清除能力,清除率与多糖浓度呈正相关性;红外图谱显示该多糖主要是β-型糖苷键连接的吡喃型葡聚糖。

拟目乌贼生殖腺,多糖,提取,抗氧化活性,红外光谱

多糖具有多种生物活性,如提高免疫、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗辐射等[1],近年来由于人们对海洋药物的重视,从海洋生物中提取多糖得到广泛关注,Murray[2]在研究发现许多海洋动物都含具有生物活性的多糖。目前从蛤蜊[3]、鲍鱼[4]、文蛤[5]、海参[6]等海洋动物中都已分离出具有生物活性的多糖。

拟目乌贼(Sepialycidas)属于软体动物门(Mollusca),头足纲(Cephalopoda),乌贼目(Sepiida),乌贼科(Sepiidae),乌贼属(Sepia),主要分布于我国东海、南海,菲律宾海,越南和婆罗洲海域[7]。由于拟目乌贼体型较大、繁殖周期短、生长迅速、肉质鲜美、蛋白质含量高以及综合利用范围广等特点[8],越来越多的学者投入到拟目乌贼人工养殖技术的研究中并取得较大进展[9-10]。随着拟目乌贼产量的增加,必然会导致占体质量30%的内脏等加工副产物增多,生殖腺作为内脏的主要组成部分,已有研究表明野生拟目乌贼生殖腺多糖含量约为鲜重的0.23%[11]。研究发现从乌贼墨[12]、海螵鞘[13]中分离的多糖均有显著的抗肿瘤活性,但是对拟目乌贼生殖腺多糖的提取及生物活性研究尚未见报道。

本文采用传统的水提法提取拟目乌贼生殖腺多糖,通过响应面法对提取工艺进行优化,并对所提取多糖的抗氧化性进行初步研究,同时利用傅里叶红外光谱对其结构进行初步探讨,以期为拟目乌贼生殖腺多糖的工业生产、分离纯化、结构分析及生物活性研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

拟目乌贼 材料购于湛江市霞山水产品批发市场,经鉴定为雌性拟目乌贼成体;苯酚、无水乙醇、浓硫酸、丙酮、葡萄糖、邻苯三酚、邻二氮菲、三氨基甲烷、硫酸亚铁等均为分析纯。

高速组织捣碎机(DS-1型) 上海标本模型厂;手提式高速中药粉碎机(DFY-200) 青州市三宝中药机械厂;冷冻干燥机(LGJ-18型) 北京四环科学仪器厂;电子天平(AUX320型) 日本岛津公司;电热恒温水浴锅(HHS型) 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;旋转蒸发器(RE-52A 型) 上海亚荣生化仪器厂;台式离心机(H/T 18MM型) 湖南赫西仪器装备有限公司;紫外可见分光光度计(UV3000型) 上海美谱达仪器有限公司;傅立叶红外光谱分析仪(Nicolet 6700型) 赛默飞世尔科技公司。

1.2 拟目乌贼生殖腺多糖提取工艺

拟目乌贼生殖腺多糖制备[14]:拟目乌贼生殖腺冻干粉的制备:拟目乌贼解剖取生殖腺,切分、捣碎、丙酮脱脂3次,冷冻干燥后粉碎,置于-20℃备用。冻干粉在设定料液比下热水浸提一定时间,离心取上清,浓缩,加入3倍体积无水乙醇4℃沉淀过夜,离心取沉淀透析48h,冷冻干燥24h得拟目乌贼生殖腺多糖。

1.3 拟目乌贼生殖腺多糖含量的测定方法

采用苯酚硫酸法测定样品中多糖含量[15]。精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖配置成100μg/mL葡萄糖标准溶液,分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL葡萄糖标准溶液于试管中,补水至2mL,然后按顺序向各试管内加入1mL 6%苯酚溶液,摇匀后速加入5mL浓硫酸,室温下放置30min,测定490nm处吸光值。按下式计算拟目乌贼生殖腺多糖得率:

式(1)

式中:R-多糖得率,%;C-待测液中多糖质量浓度,mg/mL；V-待测液体积,mL;N-稀释倍数;m-拟目乌贼生殖腺样品质量,g。

1.4 提取工艺单因素实验设计

在保持其它因素条件相同下,分别设置料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL,浸提温度50、60、70、80、90℃,浸提时间0.5、1、1.5、2、2.5h,考察各因素对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响,每个因素平行实验三次,取平均值。

1.5 提取工艺响应曲面法优化实验设计

在单因素实验的基础上,采用 Box-Behnken 设计方法以料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)3个因素为自变量进行组合优化,多糖得率(Y)为响应值,平行实验三次,进行响应面分析。利用 Design expert 8.0.6 软件进行数据处理和回归分析。实验设计方案见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken design

1.6 拟目乌贼生殖腺多糖清除自由基能力的研究

1.6.1 清除超氧阴离子自由基能力的测定 根据文献[16]方法,取1mL不同浓度的拟目乌贼生殖腺多糖溶液于试管中,加入4.5mL pH8.2的0.05mol/L Tris-HC1缓冲液、4.2mL蒸馏水混匀置于25℃水浴中预热20min,加入25℃水浴预热过的3mmol/L的邻苯三酚溶液0.3mL(邻苯三酚溶液用10mmol/L HCl配制),混匀后于325nm处测定吸光度A,每隔30s读取吸光值,4min后结束。每个多糖浓度平行实验三次取平均值,并与VC对照比较。作吸光值随时间变化的回归方程,其斜率为邻苯三酚的自氧化速率Ks,以蒸馏水代替样品为空白对照的自氧化速率为Ko。清除率计算公式为:

清除率(%)=(Ko-Ks)/Ko×100

式(2)

1.6.2 清除羟自由基能力的测定 按照文献[17]方法,取0.75mmol/L 邻二氮菲无水乙醇溶液1mL加入pH7.4的0.15mol/L的磷酸缓冲液2mL,加入1mL不同浓度拟目乌贼生殖腺多糖样品溶液,混匀后加入0.75mmol/L的硫酸亚铁溶液1mL,最后加入0.01% H2O2溶液1mL,在 37℃水浴反应60min,536nm测定其吸光度AC(样品管);以同样体积的蒸馏水代替样品及H2O2溶液,于536nm测定其吸光度AB(未损伤管);以同样体积的蒸馏水代替样品溶液,于536nm测定其吸光度AO(未损伤管)。每一样品平行测三次,取平均值,并与VC对照比较。清除率计算公式如下:

清除率(%)=(AC-AB)/(AO-AB)×100

式(3)

1.7 红外光谱(IR)分析

取2mg干燥生殖腺多糖,KBr压片,Nicolet 6700傅立叶红外光谱分析仪4000～400cm-1区间扫描。

1.8 数据处理方法

所有数据均重复测定三次,采用Design expert 8.0.6软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线的建立

采用苯酚硫酸法测定得到的葡萄糖标准曲线回归方程为:Y=7.5157X-0.0088,R2=0.9991;其中Y为吸光值,X为葡萄糖含量(mg/mL)。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响 分别选定料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL,在70℃条件下提取1.5h,研究料液比对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响,结果见图1。

图1 料液比对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响Fig.1 Effect of ratio of raw material to water on the yield of Sepia lycidas gonad polysaccharides

由图1可知,料液比对多糖得率的影响较为明显。随着料液比的增加,拟目乌贼生殖多糖得率逐渐升高,当料液比在1∶10～1∶25g/mL时,多糖得率急剧增加;高于1∶25g/mL时,得率增加缓慢。分析原因可能是料液比影响多糖的溶出,料液比较低时,溶液黏度较高,不利于多糖扩散;达到一定料液比之后,多糖扩散将不再受影响。考虑到节约资源以及后续离心、浓缩、醇沉等操作,料液比不宜过大,选择1∶25g/mL为最适提取料液比。

2.2.2 提取温度对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响 设定料液比为1∶25g/mL,分别在50、60、70、80、90℃条件下提取1.5h,考察提取温度对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响,结果见图2。

图2 提取温度对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of Sepia lycidas gonad polysaccharides

由图2可知,随着提取温度的升高,拟目乌贼生殖腺多糖得率逐渐增加。分析其原因,温度较低时,多糖的溶解度较低,不利于多糖的溶出;当温度逐渐升高,多糖分子热运动加剧,扩散速度加快,多糖得率上升。但是过高的提取温度可能会导致多糖分子的结构破坏,综合考虑80℃为最适提取温度。

2.2.3 提取时间对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响 在料液比为1∶25g/mL、提取温度为80℃条件下,分别提取0.5、1、1.5、2、2.5h,研究提取温度对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响,结果见图3。

图3 提取时间对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of Sepia lycidas gonad polysaccharides

从图3可以看出,随着提取时间的增加,拟目乌贼生殖腺多糖得率也随之增加,在提取时间达到1h之后,多糖得率增加趋势变缓。这可能是拟目乌贼生殖腺经过脱脂、冻干、粉碎之后,冻干粉能与提取溶剂充分接触,可在较短时间内使多糖溶出,继续延长提取时间对多糖得率的增加不再明显。因此,综合考虑选择1h为最适提取时间。

2.3 响应曲面法优化实验结果

2.3.1 回归模型的建立及显著性检验 在单因素实验的基础上,对料液比(A)、提取温度(B)和提取时间(C)按表1设计方案,采用Box-Behnken 设计方法设计响应面,优化拟目乌贼生殖腺多糖提取工艺。实验设计与结果见表2。利用Design expert 8.0.6软件,对表2实验数据建立二次回归模型,得拟合二次多元回归方程:

多糖得率(%)=0.73+0.018A+0.011B+0.011C+7.500E-3AB-0.014AC+4.000 E-3BC-4.333 E-3A2-3.333 E-4B2-0.011C2

式(4) 表2 响应曲面法优化实验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 Variance analysis of the regression model

注:*表示在α=0.05 水平上显著;**表示在α=0.01 水平上极显著。 对上述模型进行方差分析,结果见表3。由表3可知,此模型的p=0.0005<0.01,响应面回归模型达到极显著水平;失拟项能表示模型预测值与实际值不拟合的概率,该失拟项p=0.1986>0.05,不显著,说明该模型对本实验拟合程度较好。R2(R-Square)=0.9822,表明该模型对实验点的适配度达到98.22%,具有较高的拟合度;修正R2(Adj R-Square)=0.9502,表明该模型能解释95.02% 响应值变化,实验误差较小,可以利用该模型预测上述提取条件对多糖得率的影响。分析模型回归方程系数的p值,A、B、C、AC和 C2项的影响极显著(p<0.01),AB影响显著(p<0.05),AC、A2和B2影响不显著。

根据方差分析结果,消去不显著项,拟合方程简化为:

多糖得率(%)=0.73+0.018A+0.011B+0.011C+7.500E-3AB-0.014AC-0.011C2

式(5)

2.3.2 响应面分析 利用Design expert 8.0.6软件对表2数据进行二次多元回归拟合,所得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图4。响应面图形能较直观地反映出各因素对响应值的影响,等高线的形状可以反映出交互效应的强弱,椭圆表示二因素交互作用显著,而圆形则与之相反[18]。从图4可以看出,料液比对拟目乌贼生殖腺多糖得率的影响最显著,表现为曲面相对较陡,提取温度和提取时间对多糖得率的影响次之。料液比和提取时间的交互作用极显著,表现为等高线图较扁平;料液比与提取温度的交互影响次之,提取温度与提取时间的相互影响最小。在所考察的因素范围内,多糖得率随料液比的增大而显著增加;随提取温度的升高变化不明显;随提取时间的增加呈现缓慢上升的趋势。

图4 料液比、提取温度和提取时间交互作用的响应面图Fig.4 Response surface plots showing the effect of the ratio of raw material to water, extraction temperature and extraction time

2.3.3 优化与验证 采用Design expert 8.0.6软件运用回归模型优化的拟目乌贼生殖腺多糖的最佳提取工艺为:料液比1∶30g/mL,提取温度 90℃,提取时间1.02h,预测拟目乌贼生殖腺多糖得率为0.758%。为方便实际操作,验证实验时将上述最佳工艺条件修正为料液比1∶30g/mL,提取温度90℃,提取时间1h,在该条件下平行实验3次,多糖得率0.751%,与理论预测值相对误差为0.92%,说明该模型能较好地预测拟目乌贼生殖腺多糖提取工艺,指导工业生产。

2.4 拟目乌贼生殖腺多糖对自由基清除能力结果分析

2.4.1 清除超氧阴离子自由基能力 按1.6.1实验方法测定,并计算清除率,结果如图5所示。超氧阴离子是生物体类产生的第一个氧自由基,能引起自由基链式反应,产生活性更强的自由基,如羟基自由基等,引起细胞损伤[19]。拟目乌贼生殖腺多糖对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子自由基具有一定的抑制作用,并随浓度的增加其清除率逐渐增加,二者呈正相关。当多糖浓度达到10mg/mL时,对超氧阴离子自由基清除率接近70%,表明拟目乌贼生殖腺多糖对超氧阴离子自由基有一定的清除效果。但是和VC相比,其清除能力相对较弱,达到相同清除效果的VC浓度远低于拟目乌贼生殖腺多糖,VC浓度为0.25mg/mL时,其清除率可达到100%。

图5 多糖对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.5 Superoxide anion free radical scavenging abilities of polysaccharides

2.4.2 清除羟自由基能力 按1.6.2实验方法测定,并计算清除率,结果如图6所示。拟目乌贼生殖腺多糖和VC对羟自由基均有一定的清除作用,随着质量浓度的增加,其清除羟自由基能力也相应增加,呈现良好的量效关系。当多糖质量浓度达到10mg/mL时,对羟自由基的清除率为39.77%,表明拟目乌贼生殖腺多糖对羟自由基具有一定的清除能力。当VC浓度为0.6mg/mL时,其清除率可达到41.52%,说明拟目乌贼生殖腺多糖对羟自由基的清除能力也远低于维生素C。这可能和所提粗多糖未进行脱蛋白操作有关,吕明生等[20]对雪莲薯多糖脱蛋白后,其清除羟自由基的能力大幅增强。

图6 多糖对羟基自由基的清除作用Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging abilities of polysaccharides

2.5 拟目乌贼生殖腺多糖红外光谱分析

拟目乌贼生殖腺多糖的红外图谱如图7所示。在3449cm-1的较强峰是糖类-OH的伸缩振动峰,在2935cm-1的较弱峰是糖类C-H的伸缩振动,这两个峰是糖类化合物典型的特征吸收峰。1650cm-1有一强吸收峰,是-CHO中C=O的伸缩振动;1447cm-1和1379cm-1是=CH2的变形吸收峰[21-22];在1044～1079cm-1处的吸收峰是吡喃环糖苷(C-O-C)的伸缩振动,是糖类的特征吸收峰,也是葡聚糖的典型吸收光谱信号;930-700cm-1为糖类的环振动吸收区,在889cm-1处是典型的吡喃型葡聚糖和β-型糖苷键吸收峰[23]。综上,拟目乌贼生殖腺多糖主要是β-型糖苷键连接的吡喃型葡聚糖。

图7 拟目乌贼生殖腺多糖的红外光谱图Fig.7 IR spectrum of Sepia lycidas gonad polysaccharides

3 结论

热水浸提法是多糖提取最常用的方法,较其它方法更温和、经济、简单。本研究以拟目乌贼生殖腺为材料,采用热水浸提法提取多糖,经过浓缩、醇沉、冻干等工艺得到白色海绵状粗多糖。响应面优化所得的拟目乌贼生殖腺多糖水提最佳工艺参数为:料液比1∶30g/mL,提取温度90℃,提取时间1h,此条件下的平均得率为0.751%,与理论预测值相符,该工艺操作简单,重复性好,可指导生产实践。

生物体内自由基过多或清除缓慢均会引起分子、细胞甚至器官损伤,对于自由基清除作用的研究已成为新的热点。目前人们使用较多主要是维生素C、维生素E和甘露醇等几种抗自由基药物,开发具有强效抗氧化功能的新型药品具有重要意义。拟目乌贼生殖腺多糖具有一定的清除羟自由基、超氧阴离子自由基的能力,清除效果呈现良好的量效关系,可以探索作为食品工业和制药行业的天然抗氧化剂;IR图谱显示拟目乌贼生殖腺多糖是β-型糖苷键连接的吡喃型葡聚糖,后续分离纯化后可对其结构进一步分析。

对拟目乌贼生殖腺水提残渣进行碱法提取时,得到一定量的碱溶性多糖。但是和水提多糖操作相比较,碱提多糖操作较繁琐,提取液粘度较大且呈深黄色,有较浓的碱味,醇沉后得到黄色多糖,但相比水提法,其多糖得率更高,这可能和动物组织中酸性多糖较多有关。改善其脱色工艺后可对水提、碱提多糖分离纯化、结构以及生物活性进行探讨比较。

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食品安全责任险试点范围扩至全国

中国保监会会同国务院食品安全委员会办公室、国家食品药品监管总局联合印发《关于开展食品安全责任保险试点工作的指导意见》,标志着我国食品安全责任保险制度初步建立,相关试点工作将在全国范围内启动。

所谓食品安全责任保险,是以被保险人对因其生产经营的食品存在缺陷造成第三者人身伤亡和财产损失时依法应负的经济赔偿责任为保险标的的保险。

《指导意见》鼓励以下领域的食品生产经营单位积极投保食品安全责任保险:食品生产加工环节的肉制品、食用油、酒类、保健食品、婴幼儿配方乳粉、液态奶、软饮料、糕点等企业;经营环节的集体用餐配送单位、餐饮连锁企业、学校食堂、网络食品交易第三方平台的入网食品经营单位等;当地特有的、属于食品安全事故高发的行业和领域。

据了解,在《指导意见》下发之前,浙江、上海、山东等地就已率先通过政府引导的方式开展了食品安全责任保险的地方性试点。以首批获得批准试点食品安全责任保险的长安责任保险股份有限公司为例,其客户之一就是一家主要面向学校的用餐配送企业。

“学校配餐如果管理不好,后果很严重。”长安责任保险股份有限公司总经理李峰认为,有了食品安全责任保险后,万一发生事故,保险公司可以预先支付,给予消费者及时赔付,也能有效转移和减少企业的风险损失。

对于企业来说,投保食品安全责任保险也是一种信用背书。据保监会有关负责人士介绍,《指导意见》将食品安全责任保险试点情况纳入地方食品安全工作考核评价体系,企业投保情况也将纳入企业信用记录和分级分类管理指标体系,已投保企业可优先获得行业专项支持和政府扶持政策。

《指导意见》还提出,各地要充分发挥保险的风险控制和社会管理功能,探索建立政府、保险机构、企业、消费者多方参与、互动共赢的激励约束机制和风险防控机制,为全面推行食品安全责任保险制度积累经验。

来源：慧聪食品工业网

Study on the extraction optimization and antioxidant activity ofpolysaccharides in gonad ofSepialycidas

DAI Hong-jie1,2,SUN Yu-lin1,ZHENG Xiao-lin2,*,CHEN Dao-hai1,*

(1.Life Science and Technology School,Lingnan Normal University,Zhanjiang 524048,China;2.College of Food and Biological Engineering,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310018,China)

Using the gonad ofSepialycidasas raw material,optimization of extraction polysaccharides process was studied by using Box-Behnken design based on the results of single-factor test;antioxidant activity of polysaccharides was evaluated by its superoxide anion and hydroxyl free radical scavenging abilities. The results showed that the optimal extraction parameters were as follows:1∶30g/mL for ratio of raw material to water,90℃ for extraction temperature,and 1h for extraction time. Under the optimal conditions,the extraction rate of polysaccharides was 0.751%. The polysaccharides had good abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radical. It was indicated to a positive correlation with concentration of polysaccharides. IR spectrum showed that the polysaccharide was pyranoid glucan with β-glycosidic bond.

Sepialycidasgonad;polysaccharides;extraction;antioxidant activity;IR spectrum

2014-06-11

戴宏杰 (1990-)，男，硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏。

*通讯作者:陈道海(1963-)，男，博士，教授，研究方向：海洋药用动物的开发利用与保护研究。 郑小林(1966-)，男，博士，教授，研究方向：农产品加工与贮藏。

国家星火计划项目(2012GA780020)；广西科技合作与交流计划项目，桂科合(1346011-25)；广东省教育部产学研合作专项(2011B090400274)；广东省海洋渔业技术推广专项(A200899E01)；湛江市科技攻关项目(2011D0244)；岭南师范学院博士启动项目(ZL1313)。

TS254.1

B

1002-0306(2015)05-0198-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.033