猪繁殖与呼吸综合征实验室检测方法研究进展

于自民 鲍玉芳 何召庆/中国动物保健品有限公司



猪繁殖与呼吸综合征实验室检测方法研究进展

于自民 鲍玉芳 何召庆/中国动物保健品有限公司

猪繁殖与呼吸综合征俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，主要侵害不同日龄、品种猪的呼吸和生殖系统，在发病过程中表现为仔猪断奶前高死亡率、育成猪呼吸困难、母猪繁殖障碍为特征的高度接触性病毒传染病，近年来已成为严重危害全球养殖业最严重的疾病之一。PRRSV感染引起的病毒血症、持续感染等，对我国养猪业疫病防控构成威胁并造成惨重的经济损失，目前是影响我国养猪业最重要疫病之一。本文拟对该病的实验室检测方法进行归纳总结，以利于快速准确地诊断该病。

一、PRRS概述

PRRS是猪“高热综合征”的主要疫病之一，属于免疫抑制性疾病，常常引起继发感染，造成免疫失败等。因此国际兽疫局将其列为B类传染病，我国将其列为二类传染病。20世纪80年代末美国南部首次报道了PRRSV，随后在德国、加拿大、荷兰一些国家广泛传播。由于起初不清楚何种病原体引起，根据临床上断奶仔猪呼吸困难、严重肺炎、生产性能下降、母猪严重的繁殖障碍等，称之为“猪流行性和呼吸道综合征”、“猪蓝耳病”、“猪神秘病”等。1991年荷兰学者Wensvoort等用猪肺泡巨噬细胞（PAM）首次分离病毒（LV株），1992年美国学者分离到VR-2332株病毒。1995年我国北京地区暴发PRRS，随后类似PRRS疾病蔓延到华东、华北等地区，1996年经哈尔滨兽医研究所鉴定为PRRSV感染。2006年夏以来我国又暴发了以变异美洲型病毒（JX-A1为代表的Nsp2缺失）为病原的高致病性蓝耳病，据初步统计，猪感染PRRSV的发病率达50% 以上，死亡率20%～100%。分子流行病学调查数据显示，2006-2008年高致病性PRRSV毒株占国内流行株的78%，2009年占86%，2010-2011年占88.9%，加重了许多地区养猪业的经济负担。

二、PRRSV病原学特性及主要结构蛋白

PRRSV属于动脉炎病毒科有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因全长约15Kb，包含9个彼此重叠的开放阅读框（ORF）。PRRSV根据基因遗传变异分为北美洲型（VR-2332）和欧洲型（LeLystad）两种基因型毒株。尽管LV和VR-2332毒株几乎同时出现，且病理症状相似，但它们的遗传特性和抗原之间差异很大，欧洲型LV株和北美型VR-2332株的PRRSV基因组序列的差异达40%左右。PRRSV不同毒株间的致病力和毒力有明显的差异，目前我国主要流行的是美洲型PRRSV分离株，并在不断的变异。PRRSV的主要病毒粒子成分是蛋白质，其中GP5、M、N蛋白是主要的结构蛋白，GP5蛋白是由ORF5编码的糖基化囊膜蛋白，又称E蛋白，具有受体识别作用，是PRRSV所有结构蛋白中产生中和抗体最强的结构蛋白；M蛋白为膜基质蛋白，遗传方面最为保守，在病毒感染的早期有很重要的作用；N蛋白由ORF7编码，为核衣壳蛋白，在感染细胞中的表达水平较高且抗原性较好，一般作为诊断分析的理想靶位。对感染的PRRSV通过对E、M、N三种主要结构蛋白的抗体检测表明，检测到的抗体出现顺序依次为N、M、E蛋白抗体。

三、PRRS实验室常用诊断方法

PRRSV没有特异性的病理变化，易和其他疫病混合感染，很难确诊。所以PRRSV疑似病例必须通过临床症状、病例剖检初步诊断并结合实验室检测进行确诊。目前实验室常用的检测方法有：病毒分离（VI）、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光定量PCR、血清中和实验（SN） 、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）、间接免疫荧光抗体试验（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。

1.病毒分离。目前VI是诊断PRRSV最准确、最经典的方法。PRRSV的分布在猪体内随着PRRSV感染猪的阶段（急性感染期、康复期、持续感染期）而变化，一般在急性感染期，多采集血、肺样品较好，而在持续感染期采集口鼻棉拭及肺样品较好。病毒分离成功的关键是选取病毒含量最高的临床样品，尽量新鲜病样及时送检。PRRSV病毒分离常用猪原代肺泡巨噬细胞（PAM)，其中大多数欧洲毒株均可适应于PMA细胞。初次分离时，高致病性PRRSV一代便可适应Marc-145细胞并出现细胞聚集、固缩和脱落等典型病变，且分离成功率较高，而经典毒株PRRSV，一般需要先适应PAM细胞后，才能适应Marc-145细胞，且不易出现病变。对于在敏感细胞上不产生病变的细胞还需要结合实验室其他诊断方法（ELISA、RT-PCR、IFA）进一步鉴定。用病毒分离培养方法检测PRRSV耗时时间较长、操作繁琐等缺点，不适用于大规模的检测。VI是中华人民共和国国家标准规定的PRRS的诊断方法，多用于急性病例的确诊。

2.反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术。分子生物学技术主要包括RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR等技术。聚合酶链式反应（PCR）是实验室检测PRRSV RNA的一种敏感技术，该法不用细胞分离培养病毒，避免了交叉污染的风险，检测所需的时间也大大缩短，并且具有较高的敏感性和特异性，是临床上广泛应用诊断PRRSV的方法。RT-PCR检测方法的原理是针对PRRSV的 ORF7、ORF6和ORF1b的基因序列设计引物。1997 年S.A.Gilbert等依据ORF1b的保守序列设计引物，建立了同时鉴定美洲型和欧洲型PRRSV的多重RT-PCR和套式多重RT-PCR。2005年Kleiboeker等依据ORF7和 3’末端非编码区的保守序列设计引物及探针，建立了鉴别、定量、多重检测美洲型和欧洲型PRRSV的实时荧光定量RT-PCR法。我国农业部动物检疫所依据ORF7、ORF6保守序列设计引物建立检测PRRSV美洲型的套式RT -PCR检测试剂盒。2008年Xiao等参照GeneBank PRRSV的Nsp2基因，利用HPPRRSV在NSP2基因出现特征性的不连续的30个氨基酸（90个碱基）的缺失，针对NSP2设计引物，建立了快速诊断高致病性PRRSV的实时荧光定量RT-PCR检测技术，来区分高致病性蓝耳病毒和经典北美型蓝耳病毒。与常规的RT-PCR方法相比，该法设计了荧光探针，增强了检测的特异性，具有操作方便、结果直观、敏感性高、重复性好等优点，有广泛的应用前景。

3.血清中和试验。SN在PRRS抗体检测中特异性高，可用于免疫效果的评价。SN检测时抗体比IFA出现晚，而不适宜于急性感染性的抗体。SN在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的方法都要以此为标准进行比较。本法操作复杂，仅限于实验室研究应用，不适合大规模推广适用。SN是中华人民共和国国家标准规定用于检测PRRS病毒抗体的方法。

4.免疫过氧化酶单层细胞试验。IPMA于1994年由荷兰中央兽医研究所建立，是最早问世的检测PRRS抗体的血清学方法。该法主要在CL-2621及Marc-l45培养物上进行，可用于PRRSV的抗原检测、病毒鉴定及早期血清抗体检测。IPMA能从感染后7～15 d的猪体中检测到PRRS抗体，敏感性和特异性较好。IPMA的不足之处是实验结果可能受实验毒株和感染野毒株相关性的影响，且IPMA的检测结果需要用肉眼判断，存在一定的主观性。IPMA是中华人民共和国国家标准规定用于检测PRRS抗体的方法，多用于确定病性而不易区分病毒的抗原类型。

5.间接免疫荧光抗体试验。IFA是应用抗原抗体反应原理及异硫氰酸荧光素（FITC）标记二抗，建立检测PRRSV抗体的方法。1992年由美国Yoon等首次建立IFA，该法具有较好的敏感性和特异性，已广泛应用于北美实际检测中。1996年我国哈尔滨兽医研究所首次建立了IFA的检测方法。1997年孙颖杰等报道建立了微量IFA法检测PRRSV抗体，和美国的玻片IFA特异性敏感性相同，符合率达到100%。针对临床上新近感染PRRSV的样品易使用IFA试验，操作快速简单，检测成本低，与IPMA具有相同的特异性和敏感性。IFA是中华人民共和国国家标准规定用于检测PRRS的病毒抗体的方法，在许多国家都得到了广泛应用，已成为各国官方认可的检测方法之一。

6.间接酶联免疫吸附试验。间接ELISA主要用于检测动物感染PRSSV之后的抗体水平。1992年国外学者Albnia等应用PAM细胞培养制备病毒抗原，首次建立了检测PRRVS抗体的间接ELISA。1996年Takikawa等用PRRSV接种Marc-145制备抗原，改进了检测PRRSV抗体的ELISA方法，我国也在1996年建立了ELISA检测方法。国内外学者在PRRSV 抗体ELISA 试剂盒的研发上做了大量研究，已有用核衣壳蛋白（N蛋白）或用膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作为主要包被抗原检测PRRSV抗体的间接ELISA试剂盒面世。国外的ELISA试剂盒具有良好的特异性、敏感性和可重复性，常被一些权威部门用于PRRS抗体检测，由于此类产品价格昂贵，限制了在临床上的应用。国内学者研发的PRRS抗体检测试剂盒在灵敏度和试剂盒保存条件等方面还有待提高。2006年吴延功等以纯化的重组N蛋白为包被抗原，建立PRRSV的检测方法，同时使用国外的试剂盒对899份样品进行检测，结果表明两种方法的符合率是91.73%。ELISA方法因具备稳定性好、抗原用量少、特异性强、结果便于长期保存等优点，现已广泛用于PRRSV样品的临床检测，但存在出现假阳性结果的缺点。间接ELISA是中华人民共和国国家标准规定用于检测PRRS抗体的方法，和IFA、IPMA的特异性相似，但以间接ELISA的的敏感性最高。

四、PRRSV实验室检测时要注意的事项

正确选择样品及时送检，采集的样品最好是处于急性感染期，后期采集的样品易产生阴性或可疑结果；血清学结果的判定要慎重，因一部分注射疫苗的猪体内可以检测到病毒，诊断时需要了解猪群的发病史和疫苗接种时间；诊断PRRSV时最好是抗原和抗体检测法相结合，因血清学方法无法确定猪群感染的时间，无法区分血清学的阳性结果是由于野毒感染还是接种疫苗所引起；进行病毒分离和RNA检测的样品，必须在采集后立即冷藏保存并在2 d内送往诊断实验室，避免反复冻融。

五、PRRSV实验室诊断方法的优劣

当前我国猪群中PRRSV的感染率呈逐年上升的趋势，PRRSV的多样性、复杂性加大了该病毒防控的难度。因PRRSV几乎不能从根本上消除，所以重点应放在加强对PRRSV检测和防治上。上述几种PRRSV实验室检测方法中，分子生物技术敏感性高，特异性强，快速简便，是目前应用较广泛的PRRSV检测技术。IFA、IPMA、SN等技术需要细胞培养、工作量大，多用于科研。ELISA是具有特异性高、一次检测样品多、敏感性强，检测速度快等优点，是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，适合大规模流行病调查和大批样品的检测，所以很多国家都将其列为标准的操作方法。

总之，PRRSV的流行现状给疾病诊断带来了巨大的挑战，在实际生产中应根据不同的需要选择合适的诊断方法。一般VI、SN、IFA和IPMA不适于实际生产推广和应用，分子生物学诊断技术RT-PCR更受实验室的青睐，间接ELISA的灵敏度高、特异性强，多用于PRRS的临床诊断。

参考文献图（略）