猪APOBEC3F基因真核表达载体的构建及其在MARC145细胞中的表达定位

孟春花， 王春玲， 李静心， 李隐侠， 朱前明， 曹少先

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014;2.江苏省农业科学院动物品种改良与繁育重点实验室，江苏 南京210014;3.南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3F(Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme cayalytic polypeptide 3F，APOBEC3F)属于细胞胞嘧啶脱氨酶家族的重要成员，为固有免疫系统中的一个重要蛋白，包括APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A～APOBEC3G以及AID(活化诱导脱氨酶)等11个成员［1-2］。近年来的研究发现APOBEC家族蛋白对包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)［2-4］、泡沫病毒(Foamy virus，PFV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)［5］等多种病毒具有抑制或超突变作用，是具有广谱抗病毒活性的天然免疫分子［1-6］。APOBEC3F对病毒复制的抑制作用可以利用其胞嘧啶脱氨基酶活性，通过DNA、RNA编辑途径和非编辑途径将HIV、HBV复制过程中cDNA或RNA上的胞嘧啶(C)突变为尿嘧啶(U)，也可使5′甲基胞嘧啶(5′mC)转化为5′甲基尿嘧啶(5′mU)，引起从G到A的超突变，从而产生大量致死突变，如色氨酸密码子TGG突变为终止子TAA，降低病毒的复制效率［7-9］。但APOBEC3F是否在猪体内具有抗病毒作用未见报道。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引发，已在全世界范围内引起养猪业的巨大经济损失［10］。PRRSV的增殖对细胞有严格的选择性，MARC145细胞是猴胚胎肾上皮细胞，近年来常用于体外增殖PRRSV。本研究拟构建含增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein，GFP)的真核表达载体pEGFP-APOBEC3F，并转染MARC145细胞，检测APOBEC3F蛋白在MARC145细胞中的表达、定位，为体外研究APOBEC3F对PRRSV的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体和细胞

MARC145细胞、大肠杆菌菌株Top10为本实验室保存，pEGFP-CMV载体(图1)由本实验室构建; MARC145细胞培养条件为:DMEM培养液添加10%胎牛血清和100 mmol/L的谷氨酰胺，胰蛋白酶消化传代。

图1 pEGFP-CMV质粒图谱Fig.1 The profile of plasmic pEGFP-CMV

1.2 主要试剂

DMEM液体培养基、Trypsin/EDTA、胎牛血清、Opti-MEM、LipofectaminTMLTX Reagent、PLUSTMReagent、Trizol等试剂购自Invitrogen公司，DMSO为Sigma公司产品，M-MLV Reverse Transcription反转录酶购自Promega公司，各种限制性内切酶和PrimeSTAR®HS DNA Ploymerase购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司，快速胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自南京卡罗登生物科技有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 APOBEC3F基因的克隆

取-80℃保存的二花脸猪脾脏，Trizol法提取猪脾脏组织总RNA，M-MLV反转录获得cDNA。根据GenBank中猪APOBEC3F cDNA序列(DQ974647.1)，利用Primer Premier 5.0软件辅助设计引物，扩增猪APOBEC3F cDNA。引物序列如下:上游引物5′-GG AGATCTGGGCTCTTCCTACATGG-3′(下划线部分为BglⅡ酶切位点);下游引物5′-GTCGACGGAACTGTCTGTCATCTCGA-3′(下划线部分为SalⅠ酶切位点)，由上海英潍捷基生物公司合成。

PCR反应体系为20.0 μl，包括5×Primer star缓冲液4.0 μl，dNTP mix 1.6 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5μl，cDNA模板2.0 μl，Primer star聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，以及ddH2O 11.2 μl。反应程序:98℃10 s，59℃退火5 s，72℃延伸80 s，共40个循环;72℃延伸10 min。目的片段大小约1 350 bp。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，参照卡罗登DNA纯化回收试剂盒说明书回收PCR产物，所得PCR产物用T4 DNA连接酶与pMD19-T载体连接为pMD-APOBEC3F，然后，将连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态细胞后，在含有氨苄青霉素抗性的平板培养基上培养，挑取阳性克隆菌落摇菌。提取质粒，经PCR鉴定后，阳性克隆菌液送上海美吉生物科技有限公司测序。

1.4 APOBEC3F表达载体构建

将pEGFP-CMV载体和测序验证后的pMD-APOBEC3F分别用BglⅡ和SalⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段DNA。将回收的片段用T4 DNA Ligase连接后转化至大肠杆菌中，取转化好的菌液铺板在含氨苄青霉素的LB平板上，于37℃静置培养12 h左右，挑取单克隆，培养菌液提取质粒，用BglⅡ和SalⅠ双酶切鉴定。鉴定正确的克隆送上海美吉生物医药科技有限公司测序，命名为 pEGFP-APOBEC3F。

1.5 重组质粒转染及转染细胞的观察

MARC145细胞接种至24孔培养板，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养18～24 h，细胞汇合至80%左右时，用脂质体LTX介导pEGFP-APOBEC3F，pEGFP-CMV转染MARC145细胞，对照组细胞不转染质粒，荧光显微镜下观察转染结果［11］。

1.6 APOBEC3F基因表达水平的Q-PCR检测

分别于转染后12 h、24 h、48 h和72 h收集pEGFP-APOBEC3F、pEGFP-CMV转染组及对照组的MARC145细胞，Trizol法提取总RNA。DNase I处理后，参照TaKaRa公司试剂盒说明书反转录获得cDNA，设计合成APOBEC3F基因的Q-PCR检测引物:上游引物5′-CGGAACCGCTCCTACATC-3′;下游引物5′-GGAACTGAGCCACCTTCG-3′。实时荧光定量PCR参照TaKaRa大连宝生物公司的SYBR Green试剂盒说明书进行，反应体系为20.0 μl，包括SYBR Green Mix 10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA模板2.0 μl，ROX 0.4 μl，以及ddH2O 6.0 μl。反应程序:95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40个循环。数据通过7500 Software v 2.0.5软件分析。

1.7 APOBEC3F蛋白的细胞免疫化学检测

吸去MARC145细胞培养液，用预冷的4%多聚甲醛固定细胞15 min，用0.2%TritonX-100处理10～15 min，然后用1%BSA封闭1 h，加入兔来源单克隆抗APOBEC3F抗体(1∶100倍稀释)于4℃孵育过夜;HRP标记山羊抗兔IgG(1∶100倍稀释)，37℃孵育1 h;室温下DAB显色0.5～3.0 min，在光学显微镜下观察，棕色为APOBEC3F阳性区域。

1.8 统计分析

使用SPSS17.0统计软件one-way ANOVA进行显著性分析。

2 结果

2.1 APOBEC3F基因的克隆

APOBEC3F基因PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示约1 300 bp(图1)，大小与预期相符合。

图1 APOBEC3F基因的PCR扩增Fig.1 Amplification of APOBEC3F gene by PCR

2.2 pMD-APOBEC3F质粒的鉴定和测序

扩增后的APOBEC3F片段与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α，从抗性平皿上挑取阳性菌落，经PCR鉴定为阳性的菌液(图2)送上海美吉生物公司测序。经测序分析，获得的APOBEC3F序列与参考序列一致。

图2 pMD-APOBEC3F质粒的PCR鉴定Fig.2 Identification of plasmid pMD-APOBEC3F by PCR

2.3 pEGFP-APOBEC3F的酶切鉴定及测序

对阳性质粒用BglⅡ和SalⅠ进行酶切鉴定，可得到2个片段(图3)，片段大小与预计相符。经测序，获得的APOBEC3F序列与参考序列一致。

图3 pEGFP-APOBEC3F的酶切鉴定Fig.3 Identification of plasmid pEGFP-APOBEC3F by restriction endonucleaes digestion

2.4 pEGFP-APOBEC3F在MARC145中的转染效率

荧光显微镜下观察到MARC145细胞转染pEGFP-APOBEC3F和pEGFP-CMV 24 h后有绿色荧光(图4A)，对照组细胞未见绿色荧光(图4B)。转染后48 h pEGFP-APOBEC3F组转染效率为82.9%，略低于pEGFP-CMV转染组(84.4%)，两组差异不明显。

2.5 APOBEC3F在MARC145细胞中的表达水平变化

Q-PCR结果显示，MARC145细胞中APOBEC3F mRNA水平在pEGFP-APOBEC3F转染后24 h达到最高，随后呈下降趋势;转染空载体pEGFP-CMV组和未转染阴性对照组中APOBEC3F cDNA的表达水平极显著低于转染pEGFP-APOBEC3F组(P＜0.01)。

图4 pEGFP-APOBEC3F质粒转染MARC145细胞Fig.4 Transfection ofplasmid pEGFP-APOBEC3F in MARC145 cells

图5 APOBEC3F基因在MARC145细胞中的表达Fig.5 Expression of APOBEC3F gene in MARC145 cells

2.6 APOBEC3F蛋白在MARC145中的表达、定位

细胞免疫化学检测表明，pEGFP-APOBEC3F转染组MARC145细胞中APOBEC3F蛋白主要在细胞质中表达，pEGFP-CMV转染组MARC145细胞中未发现APOBEC3F蛋白的表达(图6)。

图6 APOBEC3F蛋白在MARC145中的表达定位Fig.6 Cellular localization of APOBEC3F in MARC145 cells

3 讨论

APOBEC3F具有广谱的抗病毒活性，可有效抑制HIV、HBV、PREV等病毒的复制，在宿主抗病毒天然免疫应答中发挥着重要作用，因此受到广泛关注［1-6，12-17］。APOBEC3F含N端模体脱氨基作用较弱，主要与APOBEC分子衣壳化、RNA结合及二聚体的形成有关，C端脱氨基模体是其发挥脱氨基作用的主要活性区域，但两者都是发挥脱氨基功能必不可少的部分［18-20］。APOBEC3F的作用机制是通过gag蛋白［19］、病毒RNA［20］、细胞RNA［21］的媒介进入成熟病毒粒子的核心，并在随后感染的靶细胞中使新合成的负链cDNA发生C→T突变，从而导致新合成的DNA降解或产生大量致死性的G→A突变来抑制病毒的复制与感染［22-25］。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是传染性极强的的反义正链RNA病毒，可以造成仔猪死亡和妊娠母猪流产及死胎、木乃伊胎。目前，PRRS的防控尚无理想方法，因为PRRSV灭活疫苗免疫后不能产生足够的保护抗体，弱毒活疫苗也只能保护同种毒株的感染，而PRRSV变异很快。宿主自身免疫能力对该病毒的复制具有重要抑制作用，因此筛选抗PRRSV能力强的个体进行抗性选育是PRRS防控的重要途径，可以从根源上解决PRRS防控难的问题。我们的前期研究结果表明:APOBEC3F的外显子8及内含子6的SNP与猪抗PRRS的能力显著相关，提示APOBEC3F可能与猪对PRRSV的易感性/抗性相关［26］。MARC145细胞是PRRSV在猪体外增殖的常用细胞系，本研究成功构建了APOBEC3F的真核表达载体并研究了其在MARC145细胞中的表达，对研究APOBEC3F对PRRSV的作用，以及探索猪PRRSV抗性差异的机制和抗PRRSV猪的选育具有重要意义。

Jonsson［16］的研究发现偶蹄动物牛、羊和猪APOBEC3F主要定位在细胞质，并能抑制HIV-1和MLV的 复 制。本 研 究 中，APOBEC3F转 染MARC145细胞后也主要在细胞质中表达，这与Jonsson等的研究结果一致。本研究中使用脂质体介导法将外源DNA导入真核细胞，是一种常用的表达外源基因的方法，这种方法具有结果可靠、重复性好、便于操作等特点，而且所携带的DNA片段大小不受限制［27］。本研究中采用的脂质体介导转染贴壁细胞系MARC145细胞的条件为本实验室建立的成熟体系［11］，在该体系中pEGFP-APOBEC3F的转染效率达到82.9%，且基本没有细胞因为转染死亡，而电穿孔法转染后细胞死亡率较高，病毒介导转染法存在安全风险［11］。

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