大豆总皂甙对运动力竭大鼠肝脏自由基代谢的影响

刘志刚， 唐文坤， 徐广艳， 陈宝平， 熊正英

(1.玉溪师范学院 体育学院，云南 玉溪 653100；2.陕西师范大学 体育学院，陕西 西安 710062)

大豆总皂甙(total soy saponins，TS)属于五环三萜的糖甙，存在于大豆中，具有多种生物学活性.按照皂甙元结构的不同可分为A组、B组、E组和DDMP皂甙.其中A组皂甙根据其配基R1、R2、R3的不同又可分为Aa-Ah八种；B组又可分为Ba、Bb、Bc、Bb′、Bc′；E组可分为Bd和Be；DDMP分为Ag、Bg、Ba、Гg和γa(如图1、图2).

图1 A组皂甙结构 图2 B组、E组和DDMP皂甙

大豆总皂甙具有多种生物学活性，如抗氧化、增强免疫等.可以使小鼠巨噬细胞的吞噬能力加强，体液免疫和细胞免疫都不同程度地得到增强，并能通过抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性来显著降低糖尿病大鼠的血糖水平，明显改善其糖耐量，同时也能改善正常大鼠葡萄糖耐量.大豆总皂甙还能明显抑制肿瘤细胞生长，保护正常细胞[1]，抑制多种病毒如单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、脊髓灰质炎、流感、麻疹、腮腺炎及柯萨奇病毒(Coxsachie virus，CV)以及显著的抗衰老作用.

1 材料与方法

1.1 材料

选用两月龄Sprague-Dawley(SD)雄性健康大鼠32只，体重(200±10)g.由西安交通大学实验动物中心提供(动物合格证编号：陕医动字第08-005)，同时购入基础饲料.

1.2 主要仪器

日立7060全自动生化分析仪；上海精科721B型分光光度计；上海精科752B型分光光度计；上海安亭TGL-16G冷冻离心机；天津泰斯特DK-98-1A恒温水浴锅；杭州段氏DSPT-202型大鼠跑台.

1.3 方法

1.3.1 动物分组：SD大鼠随机分成4组，分别为安静组(Control group)、安静加药组(TS group)、力竭组(Exhausted group)、力竭加药组(TS exhausted group).每组8只，分笼饲养，各组大鼠自由饮水、进食.饲养环境温度(25±3)℃，相对湿度45%～65%，噪声不大于50 dB，自然光照明.

1.3.2 给药：大豆总皂甙购自华北制药股份有限公司，药品纯度90%，灰分10%.安静加药组和力竭加药组给药剂量为20 mg/kg体重，以2 mL生理盐水溶解后，在每天固定的时间(9∶00-9∶30)经口腔灌注给药，每日一次，持续给药时间为2周.给药期间每3天称体重一次，及时按体重变化调整给药量.力竭组每次灌注相同剂量的生理盐水，安静组不作任何处理.

1.3.3 造模：采用一次力竭急性实验.适应环境3 d后开始给药，平时不进行任何训练，给药2周后力竭组和力竭给药组进行力竭实验.进行一次跑台力竭性运动，跑台设定速度30 m/min，跑台不加坡度，并在3 min内逐渐增加到预定的运动强度(30 m/min).记录力竭距离和时间.判断力竭标准：大鼠跟不上跑台速度，蹲坐在笼后壁，后肢随传动皮带明显后拖，腹部着地，四肢横向伸展，电流刺激毛刷驱赶无效.其行为特征为呼吸急促、神情疲倦，呈俯卧位垂头，对刺激反应迟钝，四肢不愿着传送带且颤抖明显.

1.3.4 取材和测试

大鼠运动至力竭后立即用乙醚麻醉，用大剪刀剪断头部处死，剖开腹腔，迅速取其肝脏.并以预冷的生理盐水冲洗残余血液，滤纸吸干，放置于标记好的洁净培养皿中.用手术刀切下并称取适量肝脏组织，加入4 ℃的生理盐水和适量石英砂进行研磨，按W(g):V(mL)=1∶9制成10%组织匀浆，倒入一次性离心管中，进行3 000 rpm、5 min离心沉淀后取上清进行指标测试.

1.4 指标测试方法

指标测试均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行.

1.5 数据处理

测试数据用统计软件SPSS18.0进行处理，结果以平均数±标准差(M±S)表示.组间进行独立样本t检验，P<0.05有统计学意义.并计算效应量Cohen's d值.Cohen's d值在0.2、0.5附近和大于0.8时分别代表小、中、大效应.

2 实验结果

2.1 运动大鼠力竭时间比较

表1 TS对运动大鼠力竭时间的影响(n=8)

*与力竭组相比，p<0.05.

由表1可知，TS能明显延长运动大鼠的力竭时间(P<0.05)，增长率为20.62%，t检验结果具有大的效应量(Cohen's d=1.07)，具有统计学意义.

2.2 指标测试结果

表2 TS对运动大鼠肝脏组织抗氧化能力和血清GSH-Px、ALT的影响(n=8)

与安静组相比，▲p<0.05；▲▲p<0.01；与力竭组相比，△p<0.05；Cohen's d在0.2、0.5附近和大于0.8时分别代表小、中、大效应.

由表2可知，安静状态下，TS显著提高了大鼠肝脏SOD水平，极显著提高肝脏GSH水平,降低其MDA含量；力竭运动状态下，TS显著提高大鼠肝脏SOD、CAT、GSH和T-AOC水平、血清GSH-Px水平，并降低肝脏MDA含量和血清ALT.未经过TS灌胃的大鼠力竭运动后肝脏SOD、GSH、T-AOC显著降低，MDA显著升高.

根据Cohen的标准，d值越大t检验的结果越可靠.通常把d值小于0.2时认为具有很小的效应量，即t检验结果可靠性较低；而d值在0.5附近具有中等效应量；d值大于0.8时具有大的效应量，即t检验结果具有比较大的可靠性.

3 讨 论

通常情况下，机体内有两类自由基防御系统，即酶促防御系统和非酶促防御系统.前者如SOD、CAT、GSH-Px、GR；后者如维生素E、维生素C、GSH等.一般情况下，体内自由基的产生和清除之间保持动态平衡，但在力竭性运动的情况下，体内氧化应激加强，自由基大量产生，线粒体内膜呼吸链电子漏等会使自由基产生和消除之间的平衡被打破，自由基的氧化能力超过机体的抗氧化能力而导致氧化胁迫和氧化损伤，引起生物膜脂质过氧化、攻击细胞内酶、蛋白质、核酸引起生物大分子交联、变性最后导致细胞死亡或凋亡，组织损伤和疾病发生[2-4].而SOD、CAT、GSH-Px、GR是机体最重要的抗氧化酶类，各抗氧化酶相互配合可以清除和淬灭过多的自由基.正常生理和适宜运动负荷情况下，抗氧化酶系通过各自的作用途径使机体自由基的生成与清除处于动态平衡：

但机体在进行力竭运动的情况下，自由基在体内的生成速率超过机体的清除能力，使自身的自由基代谢平衡失调，以至自由基在体内大量堆积并增强脂质过氧化水平，从而导致膜脂质、核酸以及蛋白质大分子的氧化损伤，膜损伤进一步导致膜功能障碍，通透性增大，膜蛋白功能失调，最终诱发运动性疲劳.

实验结果显示，力竭性运动使血清ALT大幅升高，说明肝细胞通透性增大或受到损伤[5]，其可能机制是：(1)运动导致体内血流重新分配，使肝脏产生缺血-再灌注损伤并可能导致钙超载，进一步使氧化磷酸化解偶联，并导致ATP含量下降.(2)肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)活性降低，AMP生成增多，在腺嘌呤脱氨酶的作用下促使腺嘌呤水解脱氨生成次黄嘌呤核苷酸(IMP)，然后经5'-核苷酸酶及核苷酶的作用生成次黄嘌呤.次黄嘌呤又在次黄嘌呤氧化酶的作用下，生成过量的超氧阴离子自由基，可引起膜脂质过氧化水平显著上升，损害肝细胞膜功能.(3)大强度运动使大鼠自由基代谢加强，摄入的氧约有2%转变成了氧自由基[6].自由基产生脂质过氧化作用，其产物丙二醛(MDA)使核酸、膜蛋白等大分子产生交联，损害膜功能.过多的自由基不断攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，使膜的流动性降低，脆性增大，从而导致膜表面分子流动力学发生改变.(4)膜内部脂质分子的变化引起膜孔隙增大，导致膜的通透性发生改变.严重时可导致膜损伤.随着膜的损伤，亚细胞器(如线粒体、高尔基体、内质网)的结构亦遭到破坏，并导致一系列的细胞功能紊乱.(5)在膜的过氧化反应中，激活了花生四烯酸代谢途径，并生成白三烯、前列腺素等具有高活性的物质，同时又生成了氧自由基，再次引发膜的脂质过氧化反应，形成正反馈，进一步加重损伤组织细胞.(6)自由基还可作用于核酸引起碱基配对错误，诱发基因突变，导致蛋白质和酶的结构变化及蛋白功能的改变和酶活性的降低.(7)力竭性运动大量消耗肝糖储备，降低了肝脏的解毒能力.同时蛋白质代谢加强产生的NH4+，超过肝脏的解毒能力而对肝脏产生毒害作用.脂肪酸不完全氧化产生过多的酮体会导致酮中毒.

实验结果表明，TS显著提高大鼠肝脏抗氧化酶活性，降低MDA水平.这可能与TS的护肝作用有关.有研究显示，TS对四氯化碳所致的肝损伤有保护作用.TS与葡萄糖醛酸结合后护肝作用增加，而单独的葡萄糖醛酸却没有此作用[7-8]，这说明TS对四氯化碳导致的肝细胞结构和功能异常有明显的抑制作用.而实验结果显示的力竭加药组比力竭组血清ALT活性大幅降低也说明了TS对肝细胞的这种保护作用.实验结果显示，力竭运动后，TS明显提高大鼠肝脏SOD、CAT、GSH、T-AOC及血清GSH-Px水平，降低MDA含量，且都具有较大的Cohen's d值.说明TS具有显著的抗氧化能力，增强机体抗氧化酶活性，降低自由基代谢产物MDA含量.推测这可能与TS直接清除自由基、并与它的多种生物学作用有关.从结构上看，TS富含酚羟基的母核可与自由基结合，形成了共振稳定的半醌式结构，中断了自由基的链式反应，起到直接清除自由基的作用.有报道TS具有较强的体外总抗氧化能力和抗活性氧能力，可抑制肝组织脂质过氧化反应，减轻肝线粒体膨胀程度[9]，抑制血浆和红细胞膜脂质过氧化作用，并能减少红细胞溶血程度[10].能够显著抑制由Fe2+-H2O2诱导的肝细胞脂质过氧化损伤和肝细胞线粒体过氧化脂质的生成[11].日本学者Yoshiki 等对DDMP皂甙进行了分子轨道法分析，认为DDMP皂甙的抗氧化活性主要与C-6部位有关，明确指出该部位是活性氧的主要消除部位[12].TS提高力竭大鼠肝脏T-AOC水平，可能是因为TS通过抗氧化酶或直接淬灭自由基，减少肝脏的氧化应激和促进糖代谢的作用有关.糖代谢加强为机体提供了大量的还原性物质，减少了对还原性维生素、氨基酸和蛋白质的消耗.TS清除自由基、保肝护肝的更多机制还需进一步的工作与研究.

4 结 论

TS可以显著提高安静和力竭运动状态下大鼠肝脏的抗氧化酶活性，保护肝细胞，降低肝内自由基代谢水平和脂质过氧化作用，降低血清ALT，对肝细胞和肝功能有明显的保护作用，并能显著提高大鼠的运动耐力.

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