有限稀释CR法筛选噬菌体cDNA文库目标克隆

周路+李建华+王丹+高剑峰

摘要：通过已知基因EST序列设计对特异性引物，经过2轮有限稀释法稀释cDNA文库；利用特异性引物作为探针，从cDNA文库中筛选出目的克隆，最终获得目的基因的全长序列。在此基础上，建立一种以CR为基础，利用有限稀释法快速、有效筛选噬菌体cDNA文库、分离全长目的基因的技术体系。

关键词：有限稀释法；噬菌体；cDNA文库；CR

中图分类号： Q785文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-0026-03

基因克隆是基因工程和分子生物学研究的基础，随着2世纪生物技术的快速发展，基因克隆技术越来越多被广泛应用[-2]。976年，Hofstetter等通过杂交质粒的方法第一个成功构建cDNA文库[3]以来，cDNA文库构建和筛选日益成熟并普及，并成为基因克隆及功能基因组研究的基本技术[4-5]，是最普遍、最经典的克隆全长基因序列的基本方法之一。传统的筛库方法以标记核酸探针技术为基础，其优点在于准确性和灵敏度高，缺点是放射性标记探针容易造成污染且同位素半衰期短不稳定，非放射性标记探针以生物素和地高辛为基础，成本高且所需工作量大。以CR为基础筛选 cDNA 文库的方法具有快捷、灵敏等特点，备受广大科研工作者青睐，如杨晓明等以CR介导的cDNA文库矩阵排列法进行混合基因组文库筛选、瞿文全等建立SSS（subsection screening）筛选cDNA文库的方法、王志成等基于96孔板CR法筛选 cDNA 文库[6-8]，等等。本研究尝试构建一种以CR为基础，结合有限稀释法筛选cDNA文库的方法，在能够快速有效分离出目的基因的基础上，减少筛选cDNA文库的工作量。

材料与方法

材料

λ噬菌体cDNA文库筛选使用由新疆石河子大学生命科学学院构建并保存的中国美利奴羊混合组织cDNA文库，宿主菌株为XL-Blue MRF，hagemid Excision所用菌株为XLOLR，均含四环素抗性。cDNA 文库构建及宿主菌株来自ZA Express cDNA Synthesis Kit试剂盒，购自Stratagene公司。

2试剂

LB液体和固体培养基、LB broth with supplement、NZY Agar，NZY Top Agar、5×NZY Broth、SM溶液、卡那霉素、四环素，均购自索莱宝公司；ITG和X-Gal，购自科百奥公司；琼脂粉、琼脂糖、低熔点琼脂糖、MgSO4，均购自Amresco公司；其余分子生物学试剂均为国产。

3引物

利用GenBank中公布的绵羊[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]预测基因EST序列，用SeqMan软件对EST序列拼接去载体，获得目的序列。将确定好的[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]基因序列，利用比较基因组学方法，比对寻找3′和 5′-UTR区域内的高度保守序列，使用remier rimer 50软件和NCBI上rimer-Blast工具设计特异性引物，并提交北京华大基因生物工程技术服务有限公司合成。

4CR反应条件

采用天根2×Taq CR Master Mix试剂盒，CR反应体系为：0×CR buffer，25 μL；25 mmol/L MgCl2，20 μL；0 mmol/L dNTMix，05 μL；0 μmol/L 正、反向引物，各 μL；模板，2 μL；Taq酶， U；ddH2O，补至 25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30次循环；72 ℃延伸8 min。CR反应结束，用%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像仪观察并照相保存。

5λ噬菌体cDNA文库筛选

λ噬菌体cDNA文库筛选流程见图。

5宿主菌的制备用接种环蘸取XL-Blue MRF′菌液在含有四环素终浓度为2 μg/mL的LB平板上划线，37 ℃过夜培养；用接种针在平板上挑取个单菌落，于20 mL LB broth with supplement中30 ℃、220 r/min振荡过夜培养；培养菌液 000 g离心5 min，弃上清，加入0 mmol/L MgSO4溶液将菌株细胞重悬稀释调至D600 nm值为06～0，4 ℃保存备用。XLOLR菌制备过程与XL-Blue MRF′相同。

52λ噬菌体cDNA目的基因确定取λ噬菌体cDNA扩增文库菌液2 μL进行CR检测。

53λ噬菌体cDNA扩增文库的第轮有限稀释筛选根据CR检测结果能够获得特异性条带，将此扩增文库菌液E管编号0；另取0只5 mL E管并编号～0号管，加入00 μL LB broth with supplement培养基，依次从各管中取00 μL培养菌液，反复吸打充分混匀，进行有限稀释；取有限稀释的各管菌液4 μL进行CR检测，如～0号管CR检测中～9号管有特异性条带，而0号管无，则选取9号管为最大稀释倍数的阳性管。[FL）]

[FK（W7][TZLtif][FK）]

[FL（2K2]

54最大稀释倍数阳性管的培养吸取最大稀释倍数的阳性管噬菌体cDNA扩增文库溶液4 μL与400 μL XL-Blue MRF′宿主菌混合均匀，37 ℃温育20 min；加入600 μL LB broth with supplement培养基混匀，37 ℃振荡培养0 h；取培养菌液2 μL进行CR检测。

55文库第2轮有限稀释筛选经CR检测有特异性条带，则将对应E管编号为a；另取0支5 mL E管各加入00 μL LB broth with supplement培养基，依次标号a～j，从培养过的最大稀释倍数阳性管取00 μL菌液加入到a号管，反复吸打充分混匀，进行有限稀释；将a～j稀释完成的菌液 37 ℃ 振荡培养0 h，取各管培养液2 μL进行CR检测，确定最大稀释倍数的阳性管；将最大稀释倍数的阳性管37 ℃继续振荡培养2 h，平均分装成2管，第管进一步进行有限稀释，验证阳性克隆的稳定性，验证完成，第2管用于噬菌体单板的挑取。

6阳性噬菌体斑的挑取

经过2轮有限稀释筛选，取最大稀释倍数的阳性管菌液2 μL与200 μL振荡过夜培养的XL-Blue MRF′菌液（D600 nm≈6）混合，并吸打均匀，于37 ℃温育20 min；将混合菌液加入到8 mL，温育在48 ℃的NZY Top Agar中，混合混匀后将NZY Top Agar混合液均匀地倒入预热的NZY Agar平板上超过20 min，至平板凝固；将凝固后的平板倒置于37 ℃温箱中培养7～8 h，直至长出清晰的噬菌斑；逐个从平板上挑取噬菌体单斑于500 μL LB broth with supplement培养基，室温条件下温育～2 h，噬菌体溶液进行CR检测，鉴定为阳性后进行hagemid Excision。

7hagemid Excision

在0 mL离心管中，加入50 μL混匀的噬菌体溶液，37 ℃ 温育5 min；在离心管中加入2 mL LB broth with supplement培养基，37 ℃、260 r/min振荡培养25～3 h；菌液 65～70 ℃ 热激20 min，以 000 g离心5 min，收集上清于无菌离心管中；取00 μL上清与200 μL XLOLR细胞吸打混匀，37 ℃ 温育5 min；加入40 μL 5×NZY Broth，37 ℃恒温培养箱培养45 min；加入5 μL 20% ITG和40 μL 25 mg/mL X-Gal充分混匀，取00 μL涂板在含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基上，倒置37 ℃培养过夜；用灭菌牙签挑取平板上白色单菌落进行CR鉴定，阳性单克隆经液体培养，送交北京华大基因生物工程技术服务有限公司测序。

2结果与分析

2引物的设计

设计引物为[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]-F：5′-AACCAAAGCTGTTGACAGATGAGAAC-3′；R：5′-GCGCTGCAGTCGACACTAGTGGATC-3′。

22λ噬菌体cDNA扩增文库目的基因的确定

取2 μL绵羊cDNA扩增文库38×08 FU/mL，利用[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]引物进行CR检测，经%琼脂糖凝胶电泳与CR marker对比，绵羊cDNA扩增文库在 800 bp 具有特异性条带（图2），表明文库中含有目的基因。

[FK（W][TZL22tif][FK）]

23有限稀释CR法目的基因筛选

由图3可见，在第轮有限稀释筛选中，～0号管均有特异性条带，且条带亮度逐渐降低，说明～0号管中总的克隆种类呈指数降低，目的基因克隆数在减少；9～0号管特异性条带微弱，说明9～0管中含有目的基因克隆且克隆数很少，9～0号管为最大稀释倍数阳性克隆管。

对9～0号管进行富集培养，取培养菌液2 μL进行CR验[CM（25]证，结果由图4可见，9～0号均有明显的特异性条带，能[CM）]

[FK（W8][TZL33tif][FK）]

[FK（W0][TZL44tif][FK）]

够进行第2轮筛选。

取0号培养管菌液00 μL进行第2轮有限稀释，取菌液经CR检测，结果由图5可见，a～j均出现特异性条带，各稀释管中均包含目的基因克隆；a～f条带亮度均一，g～j条带亮度逐渐增加，表明阳性克隆数在增加。这是有限稀释法的优点，经过第轮和第2轮筛选，非阳性克隆在减少，阳性克隆数经过富集扩大培养后大量增加，能够有效地筛选含目的基因的阳性克隆。

[FK（W9][TZL55tif][FK）]

为进一步确定j号管能够进行hagemid Excision，对j号管进行有限稀释验证。由图6可见，在有限稀释的j号管 ～6 份检测样本中均有特异性条带，表明第2轮有限稀释能够进行hagemid Excision。

[FK（W9][TZL66tif][FK）]

24hagemid Excision

经过2轮有限稀释筛选，经hagemid Excision，随机挑取6个单克隆进行CR鉴定，结果由图7可见，4个单克隆有明显的特异性条带，鉴定为含有目的基因的单克隆，将单克隆菌液送交测序。

[FK（W0][TZL77tif][FK）]

25测序结果

将测序得到的TORAI基因序列，运用DNAstar中Seqman进行拼接，在NCBI上载体搜索工具VecScreen去载体，对序列进行核苷酸序列比对，并将序列提交GenBank，GenBank登录号为KF779494。

3结论与讨论

筛选cDNA文库是获取全长目的基因的基本方法之一。从cDNA文库中获得目的全长基因，建立该基因的结构、功能、表达调控等研究体系，是在基因组水平上研究特定生物器官、组织、发育时期基因表达的前提和基础。目前，基于CR法从混合文库中筛选阳性单克隆的方法[9，]越来越受到关注。本试验构建了一种快速筛选噬菌体cDNA文库的方法——有限稀释CR法，与常规CR筛选cDNA文库方法相比，具有操作简便、检测灵敏、筛选快速、经济有效等优点。该方法以特定基因组DNA为探针筛选噬菌体cDNA文库中该基因的全长序列，摆脱了传统噬菌体文库铺板培养、分板洗脱等较为繁琐的操作步骤，只经过2轮CR就可筛选到目的基因，并将目的基因富集到较高水平，整个过程只需4 d时间。利用此项技术，能够快速有效地筛选噬菌体cDNA文库中全长序列基因，在筛选过程中不需要探针标记，降低了成本，提高了安全性，同时也降低了假阳性对试验的干扰。

有限稀释CR法快速筛选噬菌体cDNA文库技术不仅原理简单，具有普遍适用性，而且具有一定的可行性和科学性，可以根据研究需要进行改进。如需要筛选大量已知基因，可在对库液的有限稀释时进行多对引物不同基因的统一筛选，这样使得筛选cDNA文库更加高效；如对于某些在文库中丰度比较低的基因，可以先有限稀释cDNA文库，找到最高的有限稀释倍数再进行培养，提高阳性克隆在稀释菌液中的分布，再按本试验步骤进行2轮有限稀释，可得到目的基因的单克隆。因此，在筛选文库之前，应确定文库中是否含有所要的阳性克隆，对文库进行滴定，再进行有限稀释确定基因的丰度；还可对λ噬菌体cDNA扩增文库进行MASS Excision protocol，将hagemid Excision菌液保存，并利用有限稀释CR法对大量基因进行筛选，达到高效筛选cDNA文库的目的。