基因的克隆、序列特征及时间特异性表达

李小玉+张晓峰+杜伟+聂浩+唐壮+班月圆+杜小龙+程嘉翎

摘要：SAUR是生长素早期响应基因，能够被生长素快速诱导表达，本研究从桑树绿枝扦插的插穗基部皮层中克隆得到个桑树SAUR家族基因，命名为MaSAUR2（GenBank登录号：KC85288）。该基因序列全长 86 bp，ORF全长549 bp，编码82个氨基酸，蛋白质分子质量为20 700，无信号肽与跨膜区域，在第82 aa至38 aa之间有个保守的SAUR-specific结构域。桑树绿枝插穗基部经吲哚-3-乙酸（IAA）诱导处理，插穗基部皮层[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表达水平在5 min内显著上升；在绿枝扦插生根过程中，不定根长出皮层时[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因表达量显著升高。推测 MaSAUR2 参与了桑树扦插过程中不定根的形成。

关键词：桑树；MaSAUR2基因；基因克隆；序列特征；实时定量CR

中图分类号： S8882；Q9432文献标志码： A[HK]

文章编号：002-302（204）2-0034-04

植物激素在调控植物生长发育中具有十分重要的作用。而生长素普遍存在于高等植物中，在植物顶端优势的保持、植物的向光性、侧根与不定根的形成与发育、组织和器官的形成与发育等过程中发挥重要作用。由生长素在短时间内快速诱导且表达上调的基因，称为生长素早期响应基因，包括AUX/IAA、[WTBX][STBX]GH3[WTBZ][STBZ]和SAUR等3类[2]。在这3类生长素早期响应基因家族中，能够被生长素快速、强烈地诱导表达的是SAUR基因家族成员中的大多数基因[2]。SAUR基因编码的 mRNAs，分子量在9 000～2 000之间[3]。在生长素处理的 2～5 min 之内，这些mRNAs就会被很快合成[4-6]，这表明生长素在SAUR基因的转录调控中发挥着重要作用。

第个SAUR基因由McClure等于987年在大豆中首次发现[5]，随后陆续从绿豆[7]、豌豆[8]、拟南芥[9]、烟草[0]、萝卜、苹果[2]、玉米[3]、水稻[4]、高粱[5]、白菜[6]、番茄以及马铃薯[6]中鉴定出一系列SAUR基因。其中拟南芥、水稻、高粱、白菜、番茄、马铃薯中分别有72、58、7、43、99、34个SAUR基因家族成员[2，6，4-6]。这些基因中大多数不含内含子[6，6]，这可能便于其对外界快速作出应答。尽管已从不同物种中鉴定或预测出许多SAUR基因，但目前只有它们中的一小部分功能已知。在大豆和玉米中，SAUR基因主要表达于延伸组织中[7-9]，说明SAUR基因在细胞伸长过程中有着特殊功能。有报道称SAUR蛋白会在钙离子存在条件下与钙调蛋白结合，说明其可能作为第二信使介导生长素信号转导与钙/钙调蛋白之间的联系[3]。在拟南芥中过量表达SAUR9-24[2]会造成植株的根呈波浪状，子叶下胚轴变长，叶片变大，为SAUR是植物细胞伸长过程中的重要调节剂提供直接证据[20]。目前关于桑树SAUR家族基因的研究还没有报道。本研究根据Solexa mRNA测序技术构建的 cDNA 文库中获得的序列设计引物，在桑树绿枝插穗基部皮层中克隆得到条SAUR家族基因的cDNA序列，依据与其他物种同源序列对比结果，将其命名为[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。对该序列的结构特征进行了生物信息学分析。根据SAUR是植物细胞伸长过程中的重要调节剂[20]，推测该基因在扦插生根过程中发挥作用，而IAA是苗木扦插繁育中常用的生根诱导剂，因此使用荧光实时定量CR技术（real-time qRT-CR）检测[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]在桑树绿枝插穗基部经IAA诱导后的表达变化，及其在绿枝扦插生根过程中不同时期的表达情况，以期对该基因的功能研究提供依据。

材料与方法

材料及主要试剂

供试桑树品种为育7-，保存于中国农业科学院蚕业研究所试验桑园。[2]RNAiso lus、RNAiso-mate for lant Tissue、rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser、SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）均购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、dNT、Taq聚合酶、Sanrep柱式DNA胶回收试剂盒、T-载体CR产物克隆试剂盒、一步法制备高效感受态细胞试剂盒、Ecoli DH5α均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2桑树[WTBX][STBX]SAUR22[WTBZ][STBZ]基因的克隆

2引物设计委托上海伯豪生物技术有限公司通过Solexa mRNA测序技术构建桑树旺盛生长期绿枝扦插生根过程的cDNA文库。从中获得段序列，经Blast同源对比推断为SAUR家族基因。根据所得序列的开放阅读框设计引物：上游引物S2-F（5′-ATGGAAATGAATCAAATG-3′）和下游引物S2-R（5′-TTAGAACTGATTTATGGC-3′）。

22桑树总DNA、RNA提取及CR扩增取0 g桑树茎部皮层，参照CTAB法[2]提取基因组DNA。取0 g桑树茎部皮层，使用RNAiso lus和RNAiso-mate for lant Tissue提取总RNA。电泳检测RNA质量，紫外分光光度计测定DNA与RNA的D260 /D280值计算DNA与总RNA的纯度与浓度。以总RNA为模板，Oligo（dT）为引物进行反转录。将模板与引物在RNase free ddH2O中混匀，65 ℃中温浴 5 min，冰浴30 s。在上述溶液中加入5×Reaction buffer 4 μL、20 U/μL RNase Inhibitor μL、0 mmol/L dNT Mix 2 μL和200 U/μL M-MuLV RT μL，混匀后42 ℃温浴 40 min，再经70 ℃温浴0 min，之后冰浴保存，得第链cDNA。分别以DNA和第链cDNA为模板进行CR扩增，反应体系为25 μL，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ min，30个循环；72 ℃ 7 min。CR扩增产物用%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段，与pUCm-T载体连接，转化Ecoli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选，挑选阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

3桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因和编码蛋白质序列分析

使用BioEdit和ORF Finder分别分析cDNA的碱基组成、开放阅读框（ORF）。利用rotaram（http：//wwwexpasyorg/protparam/）和rotScale（http：//wwwexpasyorg/protscale/）分别在线分析目的基因编码蛋白质的理化性质和疏水性。使用TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）、Signal 4 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/Signal/）、CELLO v25 Server

（http：//cellolifenctuedutw/）[22]和SMART（http：//smartembl-heidelbergde/）分别对蛋白质的跨膜区、信号肽、亚细胞定位以及结构功能域进行预测。蛋白质的二级结构与三级结构的预测分别使用ROTER（http：//distillucdie/proter/）[23]和HYRE2（http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index）[24]来完成。同源性比对使用NCBI网站及ClustalX8多序列对比分析软件进行。利用MEGA5的Neighbor-oining（N）距离法构建系统进化树。

4桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因诱导表达的实时定量CR检测

选取桑树品种育7-母株上生长健壮、无病虫害的当年生均一的半木质化绿枝枝条，剪成5 cm长的插穗，用 500 mg/L IAA溶液浸泡插穗基部，浸泡0 s后取出分别于2、5、0、30、60 min时取插穗基部 cm内的皮层作[2]为试验材料，以未浸泡IAA的插穗作为对照，试验材料置于液氮中速冻，再于-86 ℃保存。利用RNAisolus和RNAisolus-mate for [3]lant Tissue试剂盒提取各个材料的总RNA。使用rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA第链。应用SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）及ABI 7300荧光定量CR仪（ABI公司）进行荧光实时定量CR检测。根据[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列，设计实时定量CR引物F（5′-AGCGATGCAAGTCCATAGGC-3′）和R（5′-CTTCTTCATGAGTTGCGGCG-3′）。以桑树Maactin（GenBank登录号为：DQ785808）为内参照，引物为AC-F（5′-GTTCCTGCTCGTAGTCCAA-3′）和AC-R（5′-CCATGCTATTCTCCGTCTC-3′）。反应程序：50 ℃ 2 min；95 ℃变性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 3 s，45个循环。重复3次。使用2-ΔΔCT处理数据。

5桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在绿枝扦插生根过程中表达的荧光实时定量CR检测

于7月下旬，选取育7-生长健壮、无病害的半木质化枝条剪成长约5 cm的插穗，应用程嘉翎等的发明专利技术[25]进行扦插试验。每2 d取插穗基部 cm内的皮层（不含愈伤组织和新根）为试验材料，对[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因在绿枝扦插生根发育过程中的表达情况进行检测，重复3次。

2结果与分析

2桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的克隆

从cDNA文库中得到的[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列包括个 549 bp 的开放阅读框（ORF）以及597 bp的5′端与40 bp的3′端部分序列。使用设计的引物分别以DNA和cDNA为模板进行CR，扩增产物经0%琼脂糖凝胶电泳检测，显示均为一条约550 bp的片段，与预期相符（图）。将目的片段切胶回收，与pUCm-T载体连接，转化感受态细胞，各挑选4个阳性克隆进行测序，结果与拼接对比序列结果一致。将该基因命名为[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]（GenBank登录号：KC85288）。

[FK（W3][TLXYtif][FK）]

22[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因及其编码蛋白质的序列分析

对获得的基因序列进行分析，结果（图2）表明：该cDNA全长 86 bp。该cDNA含有个549 bp的完整的开放阅读框，编码82个氨基酸残基。所编码的蛋白质分子质量约为 20 700，理论等电点pI为939。SAUR2蛋白疏水性的最小值为-3733，最大值为344；亲水区域为8～59 aa，3～27 aa，42～57 aa等，疏水区域为82～89 aa，28～34 aa，36～4 aa等。预测分析显示，该蛋白质没有信号肽与跨膜区域，蛋白位于细胞核中。通过SMART预测，该蛋白质第82 aa至38 aa之间有个保守的结构功能域—SAUR-specific domain（SSD）[3]。利用ROTER预测可知，该蛋白质二级结构组分中，α-螺旋占379%，β-折叠占8%，无规则卷曲占538%，为混合型蛋白。应用HYRE2对该蛋白质进行三级结构预测，因没有SAUR蛋白三级结构模板，预测结果的覆盖率与可信性都较低，因此不采纳。

23桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因编码氨基酸的同源性与系统进化分析

根据桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因编码的氨基酸序列，从NCBI选取部分同源氨基酸序列，利用Clustal X 20软件进行同源性多序列比对分析（图3）。结果表明，该基因与毛果杨（opulus trichocarpa，X_002303770）、可可（Theobroma cacao，EOX99720）、桃（runus[KG2]persica，EM28880）、草莓亚种Vesca（Fragaria vesca subsp Vesca，X_00430）、麻风树[2]（atropha curcas，ADU5697）、蒺藜苜蓿[3]（Medicago truncatula，[FL）]

[FK（W5][TLXY2tif][FK）]

[FK（W23][TLXY3tif][FK）]

[FL（2K2]X_003602327）、蓖麻（Ricinus communis，X_00254869）[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因编码的氨基酸的同源性分别为63%、62%、63%、59%、53%、57%、56%。同时表明参与对比的7条同源序列在结构域附近保守性强。

根据[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因推导的氨基酸序列，从NCBI数据库中下载其他6个物种的氨基酸同源序列，使用MEGA5软件进行系统进化分析。结果（图4）表明，桑树与桃、草莓亚种Vesca的亲缘关系最近，聚为一类。

24实时定量CR检测桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的诱导表达

桑树插穗经IAA诱导处理后，茎部皮层中的[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因被迅速活化，表达量明显增加，5 min后表达量达到最高，之后表达量下降（图5）。

25实时定量CR分析[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在绿枝扦插生根过程中的表达变化

在插穗生根过程中，[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表达在基部膨大期维持在一个较低的水平，而在不定根形成期，该基因的表达量显著上升（图6）。

3结论

本试验从桑树中克隆得到SAUR基因的cDNA序列，该序列全长 86 bp，包括549 bp的开放阅读框、597 bp的5′UTR和40 bp的3′UTR，没有内含子。根据用Blast软件与其他物种基因相比对的结果，将其命名为[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。该基因所表达的蛋白质与其他物种SAUR蛋白相似度不是很高，这与其他物种中SAUR蛋白的同源性普遍不高是一致的[7]。该蛋[CM（25]白没有信号肽与跨膜区域，亚细胞定位于细胞核中，在第

植物激素在调控植物生长发育中具有十分重要的作用。而生长素普遍存在于高等植物中，在植物顶端优势的保持、植物的向光性、侧根与不定根的形成与发育、组织和器官的形成与发育等过程中发挥重要作用。由生长素在短时间内快速诱导且表达上调的基因，称为生长素早期响应基因，包括AUX/IAA、[WTBX][STBX]GH3[WTBZ][STBZ]和SAUR等3类[2]。在这3类生长素早期响应基因家族中，能够被生长素快速、强烈地诱导表达的是SAUR基因家族成员中的大多数基因[2]。SAUR基因编码的 mRNAs，分子量在9 000～2 000之间[3]。在生长素处理的 2～5 min 之内，这些mRNAs就会被很快合成[4-6]，这表明生长素在SAUR基因的转录调控中发挥着重要作用。

第个SAUR基因由McClure等于987年在大豆中首次发现[5]，随后陆续从绿豆[7]、豌豆[8]、拟南芥[9]、烟草[0]、萝卜、苹果[2]、玉米[3]、水稻[4]、高粱[5]、白菜[6]、番茄以及马铃薯[6]中鉴定出一系列SAUR基因。其中拟南芥、水稻、高粱、白菜、番茄、马铃薯中分别有72、58、7、43、99、34个SAUR基因家族成员[2，6，4-6]。这些基因中大多数不含内含子[6，6]，这可能便于其对外界快速作出应答。尽管已从不同物种中鉴定或预测出许多SAUR基因，但目前只有它们中的一小部分功能已知。在大豆和玉米中，SAUR基因主要表达于延伸组织中[7-9]，说明SAUR基因在细胞伸长过程中有着特殊功能。有报道称SAUR蛋白会在钙离子存在条件下与钙调蛋白结合，说明其可能作为第二信使介导生长素信号转导与钙/钙调蛋白之间的联系[3]。在拟南芥中过量表达SAUR9-24[2]会造成植株的根呈波浪状，子叶下胚轴变长，叶片变大，为SAUR是植物细胞伸长过程中的重要调节剂提供直接证据[20]。目前关于桑树SAUR家族基因的研究还没有报道。本研究根据Solexa mRNA测序技术构建的 cDNA 文库中获得的序列设计引物，在桑树绿枝插穗基部皮层中克隆得到条SAUR家族基因的cDNA序列，依据与其他物种同源序列对比结果，将其命名为[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。对该序列的结构特征进行了生物信息学分析。根据SAUR是植物细胞伸长过程中的重要调节剂[20]，推测该基因在扦插生根过程中发挥作用，而IAA是苗木扦插繁育中常用的生根诱导剂，因此使用荧光实时定量CR技术（real-time qRT-CR）检测[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]在桑树绿枝插穗基部经IAA诱导后的表达变化，及其在绿枝扦插生根过程中不同时期的表达情况，以期对该基因的功能研究提供依据。

材料与方法

材料及主要试剂

供试桑树品种为育7-，保存于中国农业科学院蚕业研究所试验桑园。[2]RNAiso lus、RNAiso-mate for lant Tissue、rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser、SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）均购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、dNT、Taq聚合酶、Sanrep柱式DNA胶回收试剂盒、T-载体CR产物克隆试剂盒、一步法制备高效感受态细胞试剂盒、Ecoli DH5α均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2桑树[WTBX][STBX]SAUR22[WTBZ][STBZ]基因的克隆

2引物设计委托上海伯豪生物技术有限公司通过Solexa mRNA测序技术构建桑树旺盛生长期绿枝扦插生根过程的cDNA文库。从中获得段序列，经Blast同源对比推断为SAUR家族基因。根据所得序列的开放阅读框设计引物：上游引物S2-F（5′-ATGGAAATGAATCAAATG-3′）和下游引物S2-R（5′-TTAGAACTGATTTATGGC-3′）。

22桑树总DNA、RNA提取及CR扩增取0 g桑树茎部皮层，参照CTAB法[2]提取基因组DNA。取0 g桑树茎部皮层，使用RNAiso lus和RNAiso-mate for lant Tissue提取总RNA。电泳检测RNA质量，紫外分光光度计测定DNA与RNA的D260 /D280值计算DNA与总RNA的纯度与浓度。以总RNA为模板，Oligo（dT）为引物进行反转录。将模板与引物在RNase free ddH2O中混匀，65 ℃中温浴 5 min，冰浴30 s。在上述溶液中加入5×Reaction buffer 4 μL、20 U/μL RNase Inhibitor μL、0 mmol/L dNT Mix 2 μL和200 U/μL M-MuLV RT μL，混匀后42 ℃温浴 40 min，再经70 ℃温浴0 min，之后冰浴保存，得第链cDNA。分别以DNA和第链cDNA为模板进行CR扩增，反应体系为25 μL，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ min，30个循环；72 ℃ 7 min。CR扩增产物用%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段，与pUCm-T载体连接，转化Ecoli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选，挑选阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

3桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因和编码蛋白质序列分析

使用BioEdit和ORF Finder分别分析cDNA的碱基组成、开放阅读框（ORF）。利用rotaram（http：//wwwexpasyorg/protparam/）和rotScale（http：//wwwexpasyorg/protscale/）分别在线分析目的基因编码蛋白质的理化性质和疏水性。使用TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）、Signal 4 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/Signal/）、CELLO v25 Server

（http：//cellolifenctuedutw/）[22]和SMART（http：//smartembl-heidelbergde/）分别对蛋白质的跨膜区、信号肽、亚细胞定位以及结构功能域进行预测。蛋白质的二级结构与三级结构的预测分别使用ROTER（http：//distillucdie/proter/）[23]和HYRE2（http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index）[24]来完成。同源性比对使用NCBI网站及ClustalX8多序列对比分析软件进行。利用MEGA5的Neighbor-oining（N）距离法构建系统进化树。

4桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因诱导表达的实时定量CR检测

选取桑树品种育7-母株上生长健壮、无病虫害的当年生均一的半木质化绿枝枝条，剪成5 cm长的插穗，用 500 mg/L IAA溶液浸泡插穗基部，浸泡0 s后取出分别于2、5、0、30、60 min时取插穗基部 cm内的皮层作[2]为试验材料，以未浸泡IAA的插穗作为对照，试验材料置于液氮中速冻，再于-86 ℃保存。利用RNAisolus和RNAisolus-mate for [3]lant Tissue试剂盒提取各个材料的总RNA。使用rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA第链。应用SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）及ABI 7300荧光定量CR仪（ABI公司）进行荧光实时定量CR检测。根据[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列，设计实时定量CR引物F（5′-AGCGATGCAAGTCCATAGGC-3′）和R（5′-CTTCTTCATGAGTTGCGGCG-3′）。以桑树Maactin（GenBank登录号为：DQ785808）为内参照，引物为AC-F（5′-GTTCCTGCTCGTAGTCCAA-3′）和AC-R（5′-CCATGCTATTCTCCGTCTC-3′）。反应程序：50 ℃ 2 min；95 ℃变性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 3 s，45个循环。重复3次。使用2-ΔΔCT处理数据。

5桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在绿枝扦插生根过程中表达的荧光实时定量CR检测

于7月下旬，选取育7-生长健壮、无病害的半木质化枝条剪成长约5 cm的插穗，应用程嘉翎等的发明专利技术[25]进行扦插试验。每2 d取插穗基部 cm内的皮层（不含愈伤组织和新根）为试验材料，对[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因在绿枝扦插生根发育过程中的表达情况进行检测，重复3次。

2结果与分析

2桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的克隆

从cDNA文库中得到的[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列包括个 549 bp 的开放阅读框（ORF）以及597 bp的5′端与40 bp的3′端部分序列。使用设计的引物分别以DNA和cDNA为模板进行CR，扩增产物经0%琼脂糖凝胶电泳检测，显示均为一条约550 bp的片段，与预期相符（图）。将目的片段切胶回收，与pUCm-T载体连接，转化感受态细胞，各挑选4个阳性克隆进行测序，结果与拼接对比序列结果一致。将该基因命名为[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]（GenBank登录号：KC85288）。

[FK（W3][TLXYtif][FK）]

22[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因及其编码蛋白质的序列分析

对获得的基因序列进行分析，结果（图2）表明：该cDNA全长 86 bp。该cDNA含有个549 bp的完整的开放阅读框，编码82个氨基酸残基。所编码的蛋白质分子质量约为 20 700，理论等电点pI为939。SAUR2蛋白疏水性的最小值为-3733，最大值为344；亲水区域为8～59 aa，3～27 aa，42～57 aa等，疏水区域为82～89 aa，28～34 aa，36～4 aa等。预测分析显示，该蛋白质没有信号肽与跨膜区域，蛋白位于细胞核中。通过SMART预测，该蛋白质第82 aa至38 aa之间有个保守的结构功能域—SAUR-specific domain（SSD）[3]。利用ROTER预测可知，该蛋白质二级结构组分中，α-螺旋占379%，β-折叠占8%，无规则卷曲占538%，为混合型蛋白。应用HYRE2对该蛋白质进行三级结构预测，因没有SAUR蛋白三级结构模板，预测结果的覆盖率与可信性都较低，因此不采纳。

23桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因编码氨基酸的同源性与系统进化分析

根据桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因编码的氨基酸序列，从NCBI选取部分同源氨基酸序列，利用Clustal X 20软件进行同源性多序列比对分析（图3）。结果表明，该基因与毛果杨（opulus trichocarpa，X_002303770）、可可（Theobroma cacao，EOX99720）、桃（runus[KG2]persica，EM28880）、草莓亚种Vesca（Fragaria vesca subsp Vesca，X_00430）、麻风树[2]（atropha curcas，ADU5697）、蒺藜苜蓿[3]（Medicago truncatula，[FL）]

[FK（W5][TLXY2tif][FK）]

[FK（W23][TLXY3tif][FK）]

[FL（2K2]X_003602327）、蓖麻（Ricinus communis，X_00254869）[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因编码的氨基酸的同源性分别为63%、62%、63%、59%、53%、57%、56%。同时表明参与对比的7条同源序列在结构域附近保守性强。

根据[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因推导的氨基酸序列，从NCBI数据库中下载其他6个物种的氨基酸同源序列，使用MEGA5软件进行系统进化分析。结果（图4）表明，桑树与桃、草莓亚种Vesca的亲缘关系最近，聚为一类。

24实时定量CR检测桑树[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的诱导表达

桑树插穗经IAA诱导处理后，茎部皮层中的[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因被迅速活化，表达量明显增加，5 min后表达量达到最高，之后表达量下降（图5）。

25实时定量CR分析[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在绿枝扦插生根过程中的表达变化

在插穗生根过程中，[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表达在基部膨大期维持在一个较低的水平，而在不定根形成期，该基因的表达量显著上升（图6）。

3结论

本试验从桑树中克隆得到SAUR基因的cDNA序列，该序列全长 86 bp，包括549 bp的开放阅读框、597 bp的5′UTR和40 bp的3′UTR，没有内含子。根据用Blast软件与其他物种基因相比对的结果，将其命名为[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。该基因所表达的蛋白质与其他物种SAUR蛋白相似度不是很高，这与其他物种中SAUR蛋白的同源性普遍不高是一致的[7]。该蛋[CM（25]白没有信号肽与跨膜区域，亚细胞定位于细胞核中，在第