塞来昔布衍生物抑制剂CIH01对A549肺癌增殖及血管生成影响的实验研究

李宏轶喻斌

（1江苏康缘阳光药业有限公司 南京210046；2南京中医药大学药学院 江苏南京210046）

塞来昔布衍生物抑制剂CIH01对A549肺癌增殖及血管生成影响的实验研究

李宏轶1喻斌2

（1江苏康缘阳光药业有限公司 南京210046；2南京中医药大学药学院 江苏南京210046）

目的：探讨选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布衍生物CIH01对A549肺癌移植瘤的抑制作用及其对肺瘤组织血管生成的影响。方法：建立裸鼠肺癌细胞株A549移植瘤模型，连续治疗20 d，于末次给药24 h后处死动物。每周测量2次肿瘤体积及动物体重，以末次各组瘤体积计算抑瘤率。采用Mtrigel Plug实验方法，连续治疗7 d后取出皮下胶块，进行HE染色，计算各组血管数平均值。结果：完成全部治疗后，CIH01组的平均肿瘤体积为（216±25）mm3，塞来昔布组的平均肿瘤体积（391±40）mm3，对照组的平均肿瘤体积为（633±92）mm3。CIH01的抑瘤率为64%，明显优于塞来昔布组，P＜0.05。各组Matrigel内的平均血管数分别为（2.82±0.71）、（7.90±2.83）、（10.75±3.11），与塞来昔布组及对照组比较，CIH01组的平均血管数均显著减少，P＜0.01。结论：CIH01对A549移植瘤模型有明显抑制作用，其作用机制之一与抑制肿瘤血管生成有关。

CIH01；A549模型；环氧合酶-2；基质胶栓实验；血管生成

环氧化酶（cyclooxygenase，COX），又称前列腺素内过氧化物合成酶（PGHS），是前列腺素（PGs）合成过程中一个主要的限速酶，可将花生四烯酸（AA）代谢成各种前列腺素产物，从而参与机体的多种病理生理过程，如炎症、发热、出凝血机制等。近年来研究显示，环氧化酶-2（COX-2）与肺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关，COX-2抑制剂对肺癌可能具有防治作用[1]。选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布是近年来开发的新型非甾体类抗炎药（NSAID），其药理特点是选择性作用于COX-2，对COX-1的活性几乎无抑制作用，表现出良好的肠道安全性。本实验室合成的COX-2选择性抑制剂CIH01，为塞来昔布的衍生物。本实验通过观察其在裸鼠体内对A549肺癌移植瘤的抑制作用，探讨其

可能的作用机制。

1 试验材料

1.1 细胞株 人肺癌细胞株A549（购自美国ATCC细胞库）。

1.2 实验动物 SPF级Balb/c裸鼠45只，雌性，6周龄，体重18～22 g，购自南京中医药大学动物中心。1.3 主要试剂 RPMI-1640完全培养基（购自Gibco公司），含10%灭活血清，塞来昔布（国药准字J20080058）。BD Matrigel（CatNo：356237，购自上海伟进生物科技有限公司），Invitrogen bFGF（货号：13256029，购自上海浩然生物技术有限公司）。

2 试验方法

2.1 裸鼠移植瘤实验[2]将A549细胞体外单层培养，培养条件为RPMI-1640培养基，于37℃、含5%

CO2空气的培养箱中培养。1周2次用胰酶-EDTA进行消化处理传代。当细胞呈指数生长期时，收取细胞，计数。将5×106A549肿瘤细胞悬浮于0.15 ml PBS，接种于每只裸鼠的右上侧躯干。当观察到有明显瘤块形成后，开始用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V=0.5 a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。肿瘤平均体积达到120 mm3时，挑选24只肿瘤生长状态较好的荷瘤鼠分为三组。治疗组给予60 mg/kg CIH01口服，阳性对照组给予相同剂量塞来昔布，空白对照组给予等体积溶媒。连续口服给药20 d后，于24 h后CO2麻醉处死动物。根据末次肿瘤体积计算抑瘤率，抑瘤率（%）= [1-（实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）]× 100%。

2.2 基质胶栓（Matrigel Plug）实验[3]12只裸鼠腹股沟皮下分别接种0.5 ml BD Matrilgel（无酚红）与400 ng bFGF混合物后，口服给药，连续7 d，于第8天处死动物，取出皮下胶块，4%多聚甲醛固定，HE染色后（红色为新生血管，蓝色为基质胶），镜下数4个视野内的血管数量，计算平均值。

2.3 统计分析 采用SPSS17.0进行所有数据分析。本实验数据全部以（Mean±SEM）表示，用One-way ANOVA进行组间比较。如果F值有显著性差异，在ANOVA分析之后用LSD法再进行多重比较。P＜0.05为有显著性差异。

3 结果

3.1 CIH01对肿瘤体积的影响 裸鼠接种A549细胞1周后可见有皮下移植瘤出现，实验过程中动物未出现明显的精神、饮食及排便异常。完成全部治疗后，CIH01组的平均肿瘤体积为（216±25）mm3，塞来昔布组的平均肿瘤体积（391±40）mm3，对照组的平均肿瘤体积为（633±92）mm3。见图1。

3.2 各治疗组胶栓内平均血管数的变化 HE染色结果显示，塞来昔布和CIH01两者给药7 d后，都可不同程度降低皮下接种胶栓内的平均血管数。塞来昔布组的平均血管数为（7.90±2.83），较对照组（10.75±3.11）明显更低，P＜0.05。CIH01拮抗肿瘤新生血管的作用较塞来昔布更为显著，平均血管数仅为（2.82±0.71），与对照组相比有极显著差异，P＜0.01。见图2。

4 讨论

环氧化酶参与机体的多种病理生理过程，如炎症、发热、出凝血机制等是已经公认的事实。近几年来，国外诸多研究表明，COX-2除了在上述炎症等过程中发挥重要作用外，还与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，已经成为肿瘤防治的一个新靶点。COX-2促进肿瘤发生的分子机制主要涉及促进肿瘤新生血管的生成[4]、刺激肿瘤细胞的增殖[5]、抑制肿瘤细胞的凋亡[6]及促进肿瘤的浸润和转移[7]等多种机制。很多证据表明，COX-2的高表达与胃肠癌、肝癌、乳癌、胰腺癌等多种肿瘤关系密切[8～9]，并且在非小细胞肺癌尤其腺癌中亦呈现阳性表达[10]，且COX-2高表达者的肺癌细胞具有更高的侵袭性和淋巴结转移倾向，且预后不良[11]。本实验选择已知COX-2高表达的肺腺癌细胞系A549作为研究对象，对新一代非甾体类抗炎药选择性COX-2抑制剂塞来昔布的新型衍生物CIH01的体内抗肿瘤活性进行评价，并同时用塞来昔布进行比较。实验结果表明，溶媒对照组的肿瘤体积在实验结束时达到了633 mm3，CIH01在60 mg/kg剂量下，连续给药20 d，表现出显著的抑瘤作用，平均瘤体积为216 mm3（P＜0.01），TGI值为64%。其作用明显好于相同剂量的塞来昔布（肿瘤体积为391 mm3，TGI=38%），两组间比较有显著性差异（P＜0.05）。

肿瘤组织新生血管形成在肿瘤的生长、浸注和转移过程中起着极其重要的作用，肿瘤血管的生成与许多促血管生成因子的调节密切相关，bFGF是其中一种重要的血管生成促进因子。本实验结果显示，COX-2抑制剂塞来昔布及其衍生物CIH01都具有明显的抗肿瘤新生血管生成的作用。与塞来昔布比较，其衍生物具有更为明显的抗血管生成活性（P＜0.05），两者的平均血管数分别为（7.90±2.83）和（2.82±0.71）。该结果与A549肿瘤模型的实验结果基本一致。由此我们也认为，抗肿瘤血管生成作用是塞来昔布及CIH01等COX-2抑制剂抗肿瘤的一个重要机制。 尽管COX-2抑制剂塞来昔布的抗肿瘤机制尚未完全阐明，但我们的研究从体内试验揭示了塞来昔布及其衍生物CIH01对肺癌有抗肿瘤效应。鉴于塞来昔布用于治疗肺癌已经有多个临床实验在进行，因此，我们相信抗肿瘤活性更强且毒性较低的衍生物CIH01在抗肿瘤方面，将具有更加广阔的应用前景。

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Experimental Study on the Effect of Celecoxib Derivatives Inhibitor CIH01 on the Proliferation of A549 Lung Cancer and the Angiogenesis

LI Hong-yi1,YU Bin2
(1Jiangsu Kangyuan Yangguang Pharmaceutical co,LTD.Nanjing210046;
2College of pharmacy,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu210046)

Objective:To evaluate the effects of celecoxib derivatives CIH01,the cyclooxygenase-2(COX-2)selective inhibitor,on inhibiting A549 lung cancer xenograft and tumor angiogenesis.Methods:Established the tumor homograft model of lung cancer cell line A549 in nude mice,after 20 days treatment,the mice were sacrificed 24 hours after the last administration.Tumor volume and body weight were measured twice weekly and calculated tumor growth inhibition (TGI)using the last measurement.Then used Mtrigel plug assay,subcutaneous rubber blocks of all mice were removed and dyed by HE after 7 days treatment,calculated the number of vessels. Results:After the treatment,the average tumor volume of CIH01 group was(216±25)mm3,the mean tumor volume of celecoxib group was(391±40)mm3,and the mean tumor volume of control group was(633±92)mm3.The inhibition rate of CIH01 group(64%)was significantly higher than that of celecoxib group,P＜0.05.And the average number of vessels of each group was(2.82±0.71),(7.90± 2.83),and(10.75±3.11),the average number of vessels of celecoxib group reduced significantly than the celecoxib group and the control group,P＜0.01.Conclusion:CIH01 has significant inhibitory effect on A549 tumor model,the mechanism of action is related to the inhibition of tumor angiogenesis.

Celecoxib;A549 xenograft model;COX-2;Matrigel plug assay;Angiogenesis

R734.42

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.06.001