临床实验室-急性早幼粒细胞白血病早期救治中的重要参与者

肖作淼综述，王小中审校

(1、赣州市人民医院检验科，江西 赣州341000；2、南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006)

急性早幼粒细胞白血病 (acute promyelocytic leukemia,APL)俗称M3,因发病急、病情进展快，容易合并DIC继发脑出血而视为内科中的急症[1-8]。该病由特异性染色体易位即t(15;17)(q24.1;q21.1)导致早幼粒细胞异常增殖并分化障碍致机体发病。随着全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)和三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)的应用，使APL从高致死性疾病发展成为高治愈性的一类髓系白血病[7-12]。目前APL患者死亡主要发生在就诊30天内即早期死亡(early death，ED)[7-10]，该时期也成了患者的最危险时期，ED主要与患者未及时就诊或就诊后未及时得到确诊与专业救治有关[2,9,11,13]。因此，实验室在早发现早诊断过程中成为APL救治成功的重要因素，有着积极的的作用[14-18]，现就APL实验室诊断的传统与新兴手段作一综述。

1 外周血象和外周血形态检查

APL 患者发病会引起血象改变，血小板计数(BPC)大多数减少[4,16,19]，伴有血红蛋白(Hb)减低和(或)白细胞(WBC)数改变，因此患者血象多表现为三系、二系减少，或血小板减少伴WBC增高，单独血小板减少者少见。WBC和BPC数也是APL分层治疗与预后的重要指标[4,10,12,14]，WBC<10×109/L,BPC>40×109/L 为低危组， WBC<10×109/L,BPC<40×109/L为中危组，而WBC>10×109/L则划分为高危组。因APL发病时临床症状不同，患者就诊科室不同，但大多数患者就诊时都会查血象，也是涉及病源最广的项目，因此临床实验室有必要对上述血象改变者进行外周血形态筛查。在血片中大多能检见颗粒增多的异常早幼粒细胞或同时检见柴捆状细胞 (faggot cell)，这对APL诊断有重要指导意义，亦可作为临床即刻使用ATRA治疗的重要依据，故临床实验室有必要将其视为“危急值”报告临床医生。对可疑APL血象者进一步行形态学检查通常可得到重要线索，而且最快半小时内(通常1小时内)出报告，所以是实用价值很高的筛查手段，成为APL救治的第一道重要关口。

2 骨髓形态学检查(mo r p h o l o g y，M)

骨髓形态学检查是WHO白血病MIMC分型(Morphology、Immunology、Cytogenetics 和 Molecular，MICM)的基础，是诊断 APL 的传统方法[2,15,18,20]，骨髓片自然干燥经瑞(Wright)氏或瑞-吉(Wright-Giemsa)氏染色后分类计数500个有核细胞，APL患者骨髓中异常早幼粒细胞增多，此类特征性异常早幼粒细胞≥30%(NEC计数)即达到APL之英法美(French-America-British,FAB)诊断标准[21]。 根据颗粒多少及粗细，FAB分型分为M3和M3v，而国内通常分为：①粗颗粒型 (M3a)②细颗粒型(M3b)。粗颗粒型(M3a)相当于FAB分型中的M3为经典型APL；而细颗粒型(M3b)相当于M3v则为变异型APL，约占20%，主要见于WBC增高的高危组。除颗粒增多的异常早幼粒外，部分APL患者同时可见大量奥氏小体(Auer rod)的柴捆细胞[3,20,22],检见此类细胞有助于APL的诊断。骨髓形态诊断为APL者应尽快使用ATRA以减少出血风险[2,7,9,16,20]，故实验室应立即联系临床，以便及时按APL来救治患者。但约有15%~20%APL形态不典型[15,19]，需要仔细鉴别才能找到典型形态的APL细胞,要求工作人员有较丰富的骨髓形态学经验以及足够的耐心,若能结合组化染色如过氧化物酶(POX)和特异性酯酶(SE)染色则能有效地与M5b鉴别。为提高APL的救治成功率，骨髓报告有必要执行分级报告制度，即2h内电话初步报告和24h内正式报告相结合的模式，从而为早期救治赢取时间。骨髓形态学检查最快能在1h内得出骨髓像信息，且大多数APL形态学检查能够确诊，最大的优势在于方便、快捷和低廉，是APL诊断的最快速和最基本的检测方法，在APL早期救治中发挥着极其重要的作用。

3 免疫学检查(i mmu n o l o g y，I)

应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检查技术，加入单克隆抗体标记分析骨髓细胞。因APL拥有颗粒增多的异常早幼粒细胞，其图形侧向散光(SSC)增大，拥有较独特的免疫表型[2,3,15,18]，且不受染色体隐匿易位影响,最快能当天(通常为2d)出报告,与形态学检查结合能有效提高APL的诊断效率与正确率。APL最典型的表型多为CD34-HLA-DRCD13+、CD33+、CD117+, 但不属于特异性表型[3,15,17]，因为以上表型亦见于非APL的其他AML。有研究者尝试不同单抗组合将AML中APL与非APL区分开业，如Zhou联合CD11a和CD18区别于其他类型的AML[3]，其敏感性为83%，特异性达到79%；Dong等联合CD11b和CD11c为特异性达95.3%，敏感性达96.2%[15]。针对APL免疫表型不同与形态学、分子生物学分型及其预后的相关研究也越来越多[3,9,14,18]，如表达 CD2+、CD34+、CD56+提示预后不良，多见于 M3v(或 M3b)，PML/RARa融合基因多为BCR3(S型)。免疫学检查主要缺点是设备昂贵，检测费用高，随着FCM仪器的普及，其在APL的早期救治中发挥着越来越重要的作用，成为诊断APL的重要辅助手段，但目前尚不属于APL确诊方法。

4 细胞遗传学检查(c y t o g e n e t i c，C)

4.1 染色体核型(karotype)把骨髓细胞接种于RPMI1640培养液进行24~48h培养后，收获并制备染色体标本通过显带进行核型分析 染色体显带技术主要有G显带和R显带技术，前者最为常用，其染色体的带纹较多且细致，有较强大的解象力容易查出更多细微变化。而R带方法操作简便重复性好带型清晰，其显带成功率明显高于G带，对提示染色体末端的缺失和易位特别有价值，而血液病涉及染色体末端异常者较多，故在血液病核型分析应用中也越来越普遍。APL具有独特的染色体核型，其经典核型通常为t(15；17)(q24；q21)[10,20,23]，其他变异核型少于 2%[5],如 t(11；17)(q23；q21)，t(5;17)(q22；q21)t(11；17)(q12；q21)等,t(11；17)(q23;q21)对 ATRA 治疗无效。此外，t(15；17)伴随附加异常有20%~30%的检出率，但其预后与单纯t(15;17)相比并无统计学差异[16,19,24]。染色体核型是APL确诊方法之一[2,3,9,19]，主要不足是操作复杂，出报告时间长(通常7~14d)，干扰因素多使染色体培养或核型分析失败，显然不利于APL的早期救治。

4.2 荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫荧光染色 FISH方法对骨髓或外周血标本处理简单，无细胞培养要求，杂交和检测效率高，敏感性和特异性高，能同时检测中期和间期细胞的基因融合信号，应用FISH软件分析技术，可以直观地观察到融合信号，是细胞遗传学的重要补充手段，尤其是染色体培养失败或核型正常，但临床高度怀疑为隐匿易位时意义更大[21]。应用FISH检查PML/RARa融合基因，是一个简便而快速(最快当天发报告，通常为2d)的检测方法[8]，能使APL快速得到确诊，有利于APL早期救治。但FISH也存在一定的局限性：荧光显微镜昂贵、一个探针(probe)只能检测一种融合基因、只能固定检测目标基因，如要检测变异融合基因PLZF-RARa、NUM-RARa则要使用多个探针。因成本高，费用贵,在国内的临床应用中受到一定限制[25]，未能将FISH方法中简便而快速的优势应用于APL早期救治，而更多使用在染色体培养效果不佳或核型分析有疑问需要验证的情形。Rego应用免疫荧光染色技术对130例APL可疑者的抗-PML进行快速诊断(平均4h内报告)[9]，结果与PCR检测PML/RARa或染色体培养结果一致，所以抗-PML免疫荧光染色法对APL早期确诊有着重要意义，但目前在国内应用并不普遍。

5 分子生物学检查(mo l e c u l a r，M)

应用实时定量PCR (real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RQRT-PCR)技术分析技术检测PML-RARa转录本。PML-RARa融合基因通常有三种类型，由不同的断裂点所造成，6号内含子处为bcr1(L型)；6号外显子处的bcr2(V型)，及位于3号内含子的bcr3(S型)，其中bcr1断裂处最多约占55%，bcr3其次约占40%，bcr2最少约占5%[1,16]。PCR方法在核型正常的隐匿易位中同样可检出PML-RARa及变异异位如PLZF-RARa、NUM-RARa转录本，因其敏感性高(可达10-4个细胞)、费用相对较低，但相对与形态和流式检查而言技术要求较高、操作较繁杂(需要将提取的RNA逆转成cDNA)、更费时，通常在3d内可出报告，是国内确诊APL应用最为广泛的项目[1,9,10,16,27]，同时也是微小残留(minimal residual disease,MRD)监测中常用手段，在APL确诊与监测中发挥重要作用。

APL的早期死亡与出血并发症息息相关，在ATRA应用前，出血相关的早期病死率(early death rate，EDR)高达 60%[7,10]。 进入 ATRA 应用时代，多个协作组EDR报道为5%~10%[6,8,11]，但反对者的文献报道为10%~30%不等[6,9,13,26-28]，认为ATRA的使用并未能有效地降低早期死亡率，许多APL的死亡者在入组研究前已经死亡。死亡原因包括患者未及时就诊或者医院未及时明确诊断或ATRA使用过慢，导致ATRA还未能充分发挥诱导分化功能时，患者往往已继发了DIC并发脑出血，这是最大的死亡原因。目前，国内外专家达成共识：对形态学检查或临床症状上怀疑为APL的患者应使用ATRA[2,6,7,19,27]这是降低EDR有效的途径，待遗传学和分子生物学检查确诊者继续使用ATRA到完全缓解，而对于不支持者则停用ATRA临床处理方法其利大于弊。

APL属于危急病种[29]，明确诊断的时限需求应该以小时而非天来计算[1]，尽早对APL患者采取救治措施如使用ATRA、输血小板、冷沉淀是减低EDR的有效方法，因此实验室对APL早发现早诊断扮演着重要的角色。FISH或RT-PCR检测PMLRARa融合基因(转录本)和染色体核型分析是APL确诊的金标准，但三种手段时间长、费用高，在早发现和早诊断APL的实际工作中有所限制。骨髓形态学检查能够快速而准确地识别出绝大多数APL患者，是第一时间能确诊APL的检查手段，尤其对于临床上怀疑APL(包括外周血形态怀疑，或外周血WBC过低形态不确定者)，骨髓形态都能提供重要的诊断信息。而对骨髓形态不好确定的变异型(M3v)诊断，应用FCM手段能快速地得出免疫表型结果，且APL具有特征性免疫表型，所以形态与FCM联合能确保快速且准确地完成APL的诊断，为临床救治APL的提供重要依据，为进一步降低APL早期死亡率(EDR)创造条件。RT-PCR方法检测PML-RARa融合基因，能较短时间出报告为后续治疗(如蒽环类化疗药物的使用)提供依据，是临床上确诊APL最常用的方法。而血象分析是患者就诊后接受的第一项检查，大多患者发病时血象会改变，且绝大多数患者的外周血中能发现APL特征性早幼粒细胞如梁建英报道检出率为85.8%[19]，故对符合APL血象改变的标本进行涂片筛查是简单有效的方法，能为临床诊断APL提供重要的导向,尤其对出血症状或凝血检查项目改变不明显，或就诊于非血液科的患者能提供重要的诊断方向作用。但目前状况不容乐观，因为从事血分析的工作人员大多为年轻执业者，他们对形态学检查普遍经验缺乏[30,31]，对APL的危急程度亦认知不够，使外周血形态在APL筛查中的作用力下降，应当引起行业的警惕。

总之，APL属急症，其救治要求多科室、多学科的互相协作，而早发现早诊断的过程中临床实验室发挥积极的作用，是APL救治中的重要参与者。

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