常用染色体分析技术在产前诊断中的应用

黄宁综述，刘艳秋审校

(江西省妇幼保健院产前诊断中心，江西 南昌 330006)

产前诊断学是一个正迅速发展，技术不断完善的新领域，对提高人口素质，实行优生优育具有重要意义。染色体分析是产前诊断中一项重要的常用检测手段，如何对细小的染色体异常做出准确的核型分析一直是困扰产前诊断技术人员的技术难题之一。随着技术的不断发展，染色体分析方法已在传统的显带核型分析的基础上，开发了荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)，比较基因组分析 (comparative genomic hybridization，CGH)、光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)。

1 常规显带核型分析及应用

自20世纪70年代以来染色体显带核型分析一直是产前细胞遗传学诊断染色体病的标准方法，中期染色体标本经特殊处理后，能显现出着色深浅不同的横纹，通过常规的核型分析技术我们可以检测出许多染色体数目和结构异常[1]。常用的显带方法有 G、R、C、Q、N、T等分带方法。 以 G 显带最为常见，可以检出300~1000条带阶段染色体的结构异常，R显带与G显带条纹正好相反，有利于显示染色体末端缺失、重排。但在许多复杂的病例如染色体微小结构易位、非平衡易位、环形染色体、微小片段的插入、标记染色体和复杂的结构异常，通过传统的染色体显带核型往往不能发现或难以准确定位异常染色体的片段来源，对于复杂异常染色体的诊断常常比较困难。

2 F I S H及应用

FISH是一门新兴的分子遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。现已广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。其技术原理是用已知的标记单链核酸为探针，与待检染色体中单链核酸按照碱基互补原则进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，从而将特定基因在染色体上定位。FISH技术灵敏度及特异性高，能检测染色体微小缺失及重排，标本来源丰富，间期细胞、分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡细胞皆可以被检测，且能迅速得到结果[2]。但FISH技术依赖于已知的染色体异常，对通过G显带技术初步分析但不能确诊的异常染色体有重要应用价值。同时FISH只能检测一个或少数几个染色体异常，对染色体的增加比较敏感，而对染色体的缺失不甚敏感，当缺乏复杂标记染色体探针时，就难以对未知的异常染色体进行核型分析。Tepperberg等[3]对5348例有产前诊断指征的孕妇选用13、18、21、X染色体特异性探针进行未培养的羊水间期细胞分析，并与羊水中期细胞培养结果进行对照。FISH分析成功的5197例，占总数的97.2%，与中期羊水染色体细胞培养结果一致率为99.8%。对所有发现的非整倍体，FISH的敏感性为99.6%，特异性99.9%。羊水细胞培养染色体分析联合FISH技术快速、灵敏度较高、特异性较强，对于非整倍体产前诊断具有重要意义。

3 C G H及应用

CGH技术是在FISH 基础上结合消减杂交技术发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术，该技术利用两种不同的荧光分别标记待检组织基因组DNA和正常组织基因组DNA，再同时与正常淋巴细胞中期染色体进行杂交的过程，借由此比较染色体上不同荧光间的强弱比值，来检测基因组中特定基因的拷贝数变异。它通过单一的一次杂交可对整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查，还能确定一些常规显带法已发现的异常染色体定位。可用于检测组织DNA异常如缺失、扩增、复制，并在染色体上定位。CGH能全面观察染色体获得缺失情况，了解染色体臂或区带的增加或缺失[4,5]。其缺点是只能检测待检基因组中相对正常基因组平均拷贝数的变化，而不能检测易位、倒位及其他拷贝数没有变化的染色体异常，对微小的重复、缺失检测不出。阳鑫妙等[6]对1例5条染色体发生复杂易位的胎儿作出产前诊断，羊水细胞染色体结果为46,XX,t(5;7;12),t(14;21)，夫妻双方外周血染色体核型正常，应用array-CGH技术对羊水细胞进行全基因组高分辨扫描分析，了解是否有微小缺失和重复，结果显示胎儿染色体未发生微缺失或微重复，结论提示array-CGH技术与传统细胞学技术相结合，可大大提升产前诊断技术水平。

4 S K Y及应用

1996年Schrock[7]等在FISH的基础上开发出SKY技术，SKY技术应用不同荧光素标记的24种全染色体涂染探针，与中期染色体进行原位杂交，使发射光谱的所有信息用于分析。这种全染色体着色技术仅需一次荧光标记杂交，一次影像摄取，一次分析，即可使每条染色体都清楚地按照不同的着色呈现出来，其分辨率达1.5MB大小[8]，能准确识别常规染色体显带法和FISH技术难以发现的染色体异常。为复杂的染色体结构异常，来源不明的标记染色体的诊断提供了可能。但SKY技术不能识别同一条染色体内部结构异常，如倒位，缺失或重复片段的定位[9]。Yaron等[10]用SKY技术评估5例高龄产妇中额外的异常结构染色体(ESACs)，发现用SKY技术诊断非随体和环形染色体的异常结构染色体十分有效。

5 展望

传统的染色体显带核型分析一直是细胞遗传学染色体分析的金标准，具有不可替代的优势，应用G显带可以对受检人群进行全面染色体分析，检测46条染色体的数目异常、染色体平衡或非平衡易位、倒位等明显的结构异常[11,12]。相继开发出的各种分子遗传学技术实验周期短，同时具备更高的分辨率。FISH技术作为一项快速染色体检测技术，可以对常见的非整倍体染色体异常作出快速检测，正常的检验结果可以在1~2d内即可得到[2,13]，可以有效缓解孕妇紧张情绪。部分学者认为如产前诊断指征为唐氏筛查高危人群或高龄孕妇，FISH可以有效地取代核型分析，但另一些学者认为一部分有临床意义的染色体异常病例会被遗漏[14-17]，此外还存在一些FISH检测与核型分析不一致的结果[18]。额外小标记染色体是通过常规核型分析可以发现，但不能确定其来源的染色体片段，必须借助其他检测技术进行明确诊断，如aCGH、SKY[19,20]。aCGH和SKY技术作为一种新型的细胞遗传技术，克服了传统显带核型分析技术的缺点和FISH技术的局限，使得额外小标记染色体和染色体微小片段的插入、缺失及由此衍生的复杂结构异常的检测成为了可能，大大提高了产前诊断的精确度和效率[21,22]，但同时也存在一些局限性，应与其他技术结合应用[9,23]。笔者认为，在产前诊断领域，联合应用显带核型分析和FISH技术对高危孕妇人群进行检测，可以满足大部分临床需要；而对于显带技术不能确定来源的标记染色体，插入片段，微小的异常染色体结构及复杂的染色体畸变，则应用SKY技术或CGH技术一目了然，再针对异常区域设计特定探针用FISH技术进一步确认，可使产前诊断的核型确诊率和疑难核型诊断率得到提高[24,25]。随着分子遗传学技术的快速发展，产前诊断中越来越多的传统核型分析无法诊断、解释的病例得到了明确诊断，细胞遗传学技术和分子遗传学技术的结合、合理运用，无疑将开拓临床应用领域。

[1]夏家辉,戴和平,李麓芸,等.人体细胞遗传学技术的推广和应用[J].医学研究杂志,2000,29(10):14-15.

[2]Weise A,Liehr T.Fluorescence in situ hybridization for prenatal screening of chromosomal aneuploidies[J].Expert Rev Mol Diagn,2008,8(4):355-357.

[3]Tepperberg J,Pettenati MJ,Rao PN,et al.Prenatal diagnosis using interphase fluorescence in situ hybridization(FISH):2-year multicenter retrospective study and review of the literature[J].Prenat Diagn,2001,21(4):293-301.

[4]Wellesley DG,Lucassen A.Prenatal diagnosis of chromosomal imbalances[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2014,99(4):338-341.

[5]Vanakker O，Vilain C,Janssens K,et al.Implementation of genomic arrays in prenatal diagnosis:the Belgian approach to meet the challenges[J].Eur J Med Genet,2014,57(4):151-156.

[6]阳鑫妙,张甦,何平亚,等.微阵列比较基因组杂交技术对一例胎儿染色体复杂易位的产前诊断 [J].中国优生与遗传杂志,2014,22(2):32-33.

[7]Schrock E,du Manoir S,Veldman T,et al.Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes[J].Science,1996,273(5274):494-497.

[8]Bayani JM,Squire JA.Applications of SKY in cancer cytogenetics[J].Cancer Invest,2002,20(3):373-386.

[9]Belaud-Rotureau MA,Elghezal H,Bernardin C,et al.Spectral karyotyping(SKY)principle,avantages and limitations[J].Ann Biol Clin,2003,61(2):139-146.

[10]Yaron Y,Carmon E,Goldstein M,et al.The clinical application of spectral karyotyping(SKY)in the analysis of prenatally diagnosed extra structurally abnormal chromosomes(ESACs)[J].Prenat Diagn,2003,23(1):74-79.

[11]付明蕾,肖亮,朱正.21例M4EO病例的骨髓形态学及染色体分析[J].实验与检验医学,2008,26(1):47-48.

[12]吴敏华,容伯芬,陈妙婵.慢性粒细胞白血病骨髓染色体核型异常的结果分析[J].实验与检验医学,2011,29(1):87.

[13]眭维国,欧明林,陈洁晶,等.FISH技术检测桂林地区妇女宫颈上皮脱落细胞hTERC基因扩增及其临床意义[J].实验与检验医学,2011,29(1):18-20.

[14]章静,陈军,浦震,等.唐氏综合征血清学产前筛查的研究进展[J].实验与检验医学,2012,30(6):576-579.

[15]罗军,沈觎忱,孟文珍.孕中期三联检测筛查唐氏综合征的临床价值[J].实验与检验医学,2009,27(4):365-366.

[16]张军，邢雪梅，祝力琦.2666例孕中期唐氏综合症血清筛查结果分析[J].实验与检验医学,2013,31(5):494-495.

[17]Caine A,Maltby AE,Parkin CA,et al.Prenatal detection of Down’s syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13,18,and 21 by FISH or PCR without a full karyotype:a cytogenetic risk assessment[J].Lancet,2005,366(9480):123-128.

[18]Namba A,Nishiyama M,Weiser JJ,et al.Prenatal diagnosis of complex rearrangement of chromosome 21:The significance of interphase and metaphase fluorescence in situ hybridization and comparative genomic hybridization[J].Clin Case Rep,2013,1(2):50-53.

[19]廖灿,潘敏,李东至,等.光谱核型分析技术在标记染色体诊断中的应用[J].中华妇产科杂志,2008,43(5):321-324.

[20]Bi W,Breman AM,Venable SF,et al.Rapid prenatal diagnosis using uncultured amniocytes and oligonucleotide array CGH[J].Prenat Diagn,2008,28(10):943-949.

[21]马聪,占杰,马梦亚,等.应用aCGH技术检测额外小标记染色体.国际检验医学杂志,2014,35(8):952-953.

[22]Lee C,Iafrate AJ,Brothman AR.Copy number variations and clinical cytogenetic diagnosis of constitutional disorders[J].Nat Genet,2007,39(7 Suppl):48-54.

[23]Heng HH,Ye CJ,Yang F,et al.Analysis of marker or complex chromosomal rearrangements present in pre-and post-natal karyotypes utilizing a combination of G-banding,spectral karyotyping and fluorescence in situ hybridization[J].Clin Genet,2003,63(5):358-367.

[24]Chen CP,Peng CR,Chem SR,et al.Interphase fluorescence in situ hybridization characterization of mosaicism using uncultured amniocytes and cultured stimulated cord blood lymphocytes in prenatally detected Pallister-Killian syndrome[J].Taiwan J Obstet Gynecol,2014,53(4):566-571.

[25]Liehr T,Weise A,Hamid AB,et al.Multicolor FISH methods in current clinical diagnostics[J].Expert Rev Mol Diagn,2013,13(3):251-255.