微生物在食品检测中的应用

李勇，夏俊，徐国茂，赵薇娜，于学红

（江西省兽药饲料监察所，江西 南昌 330029）

食品安全是当今社会的热点话题，随着社会经济的发展，人们对食品安全越加关注，不断频发的食品安全事件[1～3]，如2011年双汇“瘦肉精”事件、台湾“塑化剂”事件，2013年新西兰奶粉检出双氰胺、广东镉大米事件，这些都促使我们加强食品安全的检测。微生物既是食品安全风险因素的其中之一，2013年俄中部城市彼尔姆因食物受沙门氏菌污染，致使近150名中学生中毒。同时也为确保食品安全发挥着积极作用，很多国家检验标准都采用微生物法来检测食品中的药物残留。本文对微生物在食品安全检测中应用进行综述。

1 微生物检测药物残留

1.1 微生物法

依据试验原理，微生物测定法[4～5]可分为稀释法、琼脂扩散法和比浊法。琼脂扩散法也叫管碟法，是微生物法中最常用的方法，抗生素管碟法是利用抗生素能在均匀涂布有待定试验菌的固体平板内呈球面形扩散，使得抗生素浓度在一定区域内呈球形递减，因此抑制了试验菌的繁殖，在固体平板出现透明的抑菌圈。此方法依据抗生素在一定浓度内，其剂量与抑菌圈的直径呈线性相关，通过标准品与待测样品形成抑菌圈大小的比较，就可以计算出待测样品的效价。管碟琼脂扩散法的种类很多，主要有微生物拭子法、德国三碟实验法、欧盟四碟实验法等，并且很多已经商品化[6～7]。上述方法符合食品安全和食品营养法典委员会对快速筛选法的要求，能快速、灵敏进行大批量的样品检测，操作简便，同时可以检出最高残留限量的样品药物残留。用微生物检测法快速检测药物残留时会产生一定的假阳性，这在一定范围内是可以接受的，如发现假阳性，可进一步用仪器检测进行确证。李延华[8]等利用嗜热脂肪芽孢纸片法（BSDA）、TCC法和试管扩散法对牛乳中的三种β-内酰胺类抗生素残留进行了比较研究，发现试管扩散法可以作为BSDA和TCC法的补充，具有经济省时、简便易行、检出限较低的优点。可以弥补度BSDA和TCC法的缺陷，建议采用试管扩散法作为补充,应用于牛乳中β-内酞胺酶检测。

1.2 抗生素残留的微生物检测法

由于抗生素能够抑制微生物的生长，抗生素残留的微生物检测法首先要筛选出对抗生素敏感的实验菌，根据实验菌产生抑菌圈大小与抗生素浓度成正相关来测定待测样品的抗生素残留。该方法由于不需特殊设备，前处理简单，剂量关系良好，能同时筛选大批量的样品，是最常见的筛选方法。我国农业部第236号公告[9]就采用微生物法检测动物性食品中苯哇西林和青霉素类抗生素残留，邢应寿等[10]以藤黄微球菌为指示菌，研究了鸡肉中环丙沙星残留的微生物检测法，标准曲线的线性范围为0.12～1.92 μg/mL，r=0.998，环丙沙星在肌肉、肝脏和肾脏中的最低检测限分别为0.025μg/g、0.30μg/g、0.03μg/g，该方法的精密度良好，变异系数在15%以内，具有较大的真实度，回收率大于70%，可用于此类药物残留的检测。李娜[11]采用微生物法对鸡组织中三种聚醚类抗生素残留进行了研究，结果表明同一种药物的最低检测限在不同菌种条件下会发生变化。莫能菌素的最低检测限在1.0～2.0μg/mL之间、马杜霉素的最低检测限分布在1.5～2.5μg/mL之间、盐霉素的最低检测限分布在0.25～2.0μg/mL之间，且线性良好，能够适用于上述药物的筛选。

综上所述，抗生素残留微生物检测方法剂量关系良好，抑菌圈与实际药物含量的相关性高，应用范围广，操作简单，不需要大型仪器，检测成本较低，可以大批量筛选，对其进行研究是很必要的，目前，微生物法的主要研究进展以抗生素为主。

2 微生物法快速筛查药物残留

2.1 采用微生物抑制法可以快速检测动物源性食品的抗生素残留,由于检测成本低，条件简单，并可以快速高效的大批量检测多种抗生素，特别适合养殖场和基层实验室使用。王志强[12]等利用5种测试菌株对鸡肉、猪肉、鱼肉、虾肉中抗生素最低检出量分别进行测试，结论显示：在15～18h内15中抗生素检测灵敏度好，最低检出限量在0.0025～0.05mg/kg之间，此法对养殖业常使用的抗生素均有良好的敏感性，最低残留检出限均达到我国农业部第235号文件《动物源性食品中兽药最高残留限量》的限量要求。随着微生物法研究的深入，微生物法与其它方法相互交叉，彼此渗透，对促进药物残留检测具有重要意义。郑晶[13～14]对微生物抑制法与酶联免疫法检测鳗鱼中喹诺酮类药物残留进行综合评估，结果表明微生物抑制法较酶联免疫方法更适用于整类药物的检测,酶联免疫法灵敏度更高一些，两种方法均适用于喹诺酮类药物残留样品的快速筛选检测。

2.2 高通量筛选(Highthroughputscreening)技术以微板作为实验载体，运用计算机自动化操作试验过程及数据分析，在同一时间可检测大量的样品，具有快速、微量、灵敏和准确等特点，是未来筛选方法的发展方向。

刘兴泉[15～16]等采用采用高通量微生物法，以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌，建立了鸡蛋中土霉素、四环素、金霉素和新霉素的检测方法，检测限为0.08～0.16 mg/kg。采用96孔微板进行抗生素残留的微生物筛选检测，可以在一个板上同时进行多个样品检测，在4～5h内即可筛选出几十个样品，具有快速高效的特点，适于推广应用，是对微生物法检测药物残留新的拓展，值得继续研究与开发。

2.3 微生物检测已经向半定量和定量方向发展，并且不断走向成熟，很多已经取得国家认可，2002年颁布蜂蜜中青霉素的含量采用微生物法[17]，其检测范围:0.025～0.20mg/kg。农业部2003年1月22日发布第236号公告，发布了12个食品中兽药残留检测方法，第九法为动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法-微生物法，该方法明确指出适用于鸡的肌肉、肝脏和肾脏中青霉素类抗生素残留的检测。王大菊等[18]以藤黄八叠球菌（Sarcinalutea）为工作菌,用杯碟法测定氨苄青霉素在猪和肉鸡组织中的残留。结果表明,氨苄青霉素在磷酸盐缓冲液、肌肉和脂肪、肝脏和肾脏中的最低检测限分别为0.00125μg/mL、0.00625μg/g和0.0125μg/g。温芳[19]等以支气管炎博代特氏菌(Bordetellabronchiseptica)ATCC4617作为检测菌株来检测硫酸粘杆菌素，结果证明在肌肉、肝脏和肾脏组织中，标准曲线在0.025～6.4μg/mL范围内线性关系良好，r分别为0.9970、0.9994、0.9990，n=9，硫酸粘杆菌素检测限肌肉组织为0.15μg/g,肝脏和肾脏组织均为0.20μg/g，低于农业部和欧盟规定的粘杆菌素最高残留限量，说明微生物多药物残留的检测已经大大扩展，目前主要研究方向为，一是敏感菌株的筛选，二是定量准确性及应用范围的研究。

2008年发布的进出口标准[20～21]采用了微生物抑制法检测动物源性食品中β-内酰胺类药物残留。可应用于青霉素类和头孢噻呋等药物残留的筛选检测，牛奶中青霉素类方法检测限在4～20μg/kg，头孢噻呋为100μg/kg，肉类、鱼和虾中的检测限高于牛奶，如发现阳性，结果需应用其他方法进行确证。

由卫生部发布的乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法同样采用对藤黄微球菌敏感杯碟法，利用此方法的检出限为4u/mL。这对药物残留的检测起了很大的促进作用，是确保食品安全的一道封锁线。微生物学方法是目前用于药物残留最普通的非仪器方法。

3 微生物法药物检测的影响因素

贺微、高晔[22]采用正交试验法研究了罗红霉素微生物检定法的最佳实验条件，平皿分成上下两排，上排先滴加低浓度标准液，下排按逆时针方向滴样，加完菌层下后排平皿转180°，滴样量用移液器定量滴样为最佳实验，根据文献[23]报道及操作经验，微生物菌悬液浓度，培养基的成分，培养基的厚度，检测方法，加样方法等都会对实验结果有重大影响。包红朵等[24]综述了影响微生物法测定药物残留灵敏度的主要因素，分别为工作菌种的选择,菌液浓度的确定,载药量的工具,培养基的成分、厚度、pH,方法制定过程中空白组织样的选择,并指出要对筛选出的敏感菌株要进行保护，进一步优化培养基的组分,通过添加辅助成分，提高培养基的显示灵敏度，从而提高微生物加测药物残留的准确度。

4 微生物检测存在的问题及展望

目前，食品中药物残留的主要检测方法以仪器分析[25～26]为主，此法投入较大，前处理复杂，对检测人员的要求高，难以大批量检测。其它辅助方法有生化免疫分析法，专一试剂盒检测，上述方法各有其优缺点。

判断一个药物残留[27]筛选方法是否可靠，需要看它能否同时分析大量样品，并且经济效益具显著。更加需要有定量性质,即假阴性率应小于5%。定量方法通常分为第一定量法和第二定量法，第一定量方法有微生物法、抗原抗体结合法和化学法三种或三种结合方法，原则上要求在允许量浓度范围测定结果应可靠,可以提高方法的通用性。第二定量方法一般用于确证第一定量方法。它用测定的标准品作为参考标准。有时确证法只需要色层反应或琼脂板上的抑菌圈即可,只作为确证，不作进一步深入研究。目前应用最多的确证技术液相和质谱,质谱用于鉴定母体离子或碎片离子的质量。现在质谱的发展以相液和气相色谱联用为主，高分辨质谱的出现将大大扩展其应用范围。

目前，微生物法多用于筛选，定量方法以仪器分析为主，检测方向主要以抗生素为主，应用范围受到一定限制。所以未来微生物法的发展方向主要有：一是筛选更加广泛的菌株，并进行优化和保存；二是改变培养基组分，使得定量更加精确，易于观察，如改变培养基颜色的辅助物质；三是与其它技术交叉，实现微生物反应器的产业化，如高通量技术，酶酶联免疫法等，使得操作更加简便易行。

[1]姚敬业.1966年发生在日本的大肠杆菌O157：H7食物中毒

[J].安徽预防医学,2000，6(1):79.

[2]卫生部,关于2001年重大食物中毒情况通报[J].中国食品卫生杂志,2002,14(4)：62.

[3]Robert V.Tauxe. Emerging food borne pathogens [J] .InternationalJournal of microboology , 2002,78(3):31～34.

[4]Pikkemaat M G, Dijk S O, Schouten J, et al. A new microbialscreening method for the detection of antimicrobial residues inslaughter animals: The Nouws antibiotic test (NAT-screening) [J].Food Control, 2008, 19: 781～789

[5]Pikkemaat M G. Microbial screening methods for detection ofantibiotic residues in slaughter animals [J]. Anal Bioanal Chem,2009, 395: 893～905.

[6]卢运战,祁克宗,朱良强.四环素类药物残留检测方法研究进展[J].2006(10).

[7]McNally M E P. Method Development in supercritical fluidextraction. J AOAC Int,1996 ,79 (2):380～387.

[8]李延华.微生物法检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的对比研究[J].中国抗生素杂志,2009,34(1).

[9]SN/T2127-2008进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法微生物抑制法[S].

[10]邢应寿,祁克宗,汪雪雁.肉鸡组织中环丙沙星残留的微生物学检测方法的建立[J]..动物医学进展,2006,27(9):70～74.

[11]李娜.鸡组织中三种聚醚类抗生素残留的微生物法检测研究[D].安徽:安徽农业大学,2007:1～73.

[12]王志强,胡国媛,李志勇,等.微生物抑制法快速检测动物源性食品多种抗生素残留[J].中国卫生检验杂志，2008,18（9）:1732～1734

[13]郑晶,黄晓蓉,郑俊超,等.微生物抑制法与酶联免疫法检测鳗鱼中喹诺酮类药物残留的比较研究[J].中国卫生检验杂志，2006,16（1）:79～81.

[14]李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社,2002,257～258.

[15]刘兴泉,冯震,姚蕾，等.采用高通量微生物法检测四种抗生素在鸡蛋中的残留[J].现代食品科技，2011,27（4）:465～467.

[16]翟云忠,吴建敏,徐俊，等.鸡蛋中抗生素残留微生物法快速检测的研究[J].现代食品科技,2008,24(8):839～841.

[17]GB/T18932.9-2002蜂蜜中青霉素残留量的测定方法杯碟法[S].

[18]王大菊，袁宗辉，范盛先，等.氨苄青霉素在猪和鸡组织残留的微生物测定法研究[J].华中农业大学学报，1999,18（3）:245～247.

[19]温芳,肖希龙.鸡组织中硫酸粘杆菌素残留的微生物学检测方法研究[J].中国兽药杂志，2006，40（7）：29～33.

[20]宋士波.动物组织中抗菌药物残留微生物筛选方法研究[D].武汉:华中农业大学,2002.

[21]郑晶,黄晓蓉,吴谦.进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法微生物抑制法，SN/T2127-2008[S].

[22]贺微，高晔.正交法探讨抗生素微生物检定法的影响因素[J].实用医药杂志，2004，21（4）:354～355.

[23]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社出版,2001,229～267.

[24]包红朵，郑勤，王冉，等.微生物法测定抗菌素残留灵敏度的影响因素概述[J].江苏农业学报，2008,24（5）：720～724.

[25]农以宁,蔡江帆,蒙肇云,等.SPE-HPLC法同时测定猪肉中常见抗生素和克伦特罗的研究[J].桂林电子科技大学学报,2009,29(5):406～409.

[26]农业部1025号公告-7,2008,动物性食品中磺胺类药物残留检测酶联免疫吸附法[S].

[27]沈炽昌.兽药残留分析方法综述[J].中国兽药杂志,1988（2）:40～42.