以低浓度异甘草素为基质的MALDI-TOF MS用于小分子的检测研究

黄 良，杨洪梅,2，石 磊，刘淑莹,2

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，长春质谱中心，吉林 长春 130022；.中国核工业建设集团公司，核建清洁能源有限公司，北京 100037)



以低浓度异甘草素为基质的MALDI-TOF MS用于小分子的检测研究

黄 良1，杨洪梅1,2，石 磊3，刘淑莹1,2

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，长春质谱中心，吉林 长春 130022；.中国核工业建设集团公司，核建清洁能源有限公司，北京 100037)

以低浓度异甘草素(ISL，0.05 mmol/L)为基质，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对精氨酸、甘露醇和苏氨酸-亮氨酸二肽等小分子物质进行分析检测。实验结果表明，以低浓度异甘草素作为MALDI-TOF MS分析小分子物质的有机基质，所获得的斑点均匀性和重复性、耐盐能力、分辨率等均显著优于常用基质2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)。本实验可为有机基质在小分子分析中的应用开辟新的窗口。

异甘草素(ISL)；基质；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)；小分子物质

基质辅助激光解吸电离(MALDI)是一种软电离技术，其原理是用激光照射样品与基质形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量后传递给样品分子，从而使样品分子电离[1-2]。在飞行时间质量分析器(TOF)中，离子在电场作用下加速通过飞行管道，待测离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比，因此可根据到达检测器的飞行时间来测定离子的质荷比[3]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是由MALDI离子源和TOF两部分组成，它克服了生物大分子电离困难的问题，为研究生物大分子物质提供了一种简单的方法。在生物大分子的研究中，常用的基质有2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)等[4-6]，这些基质在常用的激光波长(N2源，337 nm)下都有很好的吸收，并且能够与样品分子形成均匀的微晶固体，从而获得比较理想的质谱图。由于基质离子峰干扰太强等原因，以上的有机基质不能用于小分子的MALDI-MS分析，这在一定程度上阻碍了MALDI-MS在小分子物质分析研究中的应用。因此，在过去的十几年里，MALDI-MS主要应用于大聚合物、生物大分子和一些热不稳定、易碎、不挥发性的化合物，如蛋白质等的研究[7-9]。近年来，研究者付出了很多努力去消除基质离子的干扰，如Dong等[10]采用石墨烯作为基质分析小分子物质；Xu等[11-12]采用碳纳米管作为基质用于MALDI-TOF MS对小分子

进行了分析。这些无机材料作为基质用于分析小分子物质与常用的CHCA和THAP等有机材料相比有很大的突破，但关于有机化合物中能够较理想的分析小分子物质的报道仍然较少。

异甘草素(4,2′,4′-三羟基查耳酮，ISL)是一类具有查儿酮结构的黄酮类化合物，为黄色针状结晶，难溶于水，可溶于极性小的溶剂，如乙醚、氯仿等。ISL主要存在于豆科植物甘草的根，鹰嘴豆(CicerarietinumL.)的幼苗、豆芽，红芪(RadixHedysari)、黄芪(RachxAstragali)、滇黄精(Polygonatumkingianum)的根，串果藤(Sinofranchetiachinensis)、香殊兰(Crinumbulbispermum)的球茎中，具有抗肿瘤、抗氧化、镇咳祛痰、解痉、扩血管、脑保护等多种药理作用[13-14]，在337 nm有较强的吸收[15]。ISL、DHB和THAP的结构示于图1。

本工作拟用低浓度的ISL和传统的DHB、THAP作为基质，采用MALDI-TOF MS分析精氨酸、甘露醇和苏氨酸-亮氨酸二肽等小分子物质，旨在为有机基质在小分子分析中的应用开辟新的窗口。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

MALDI-TOF MS仪(Voyager DE-STR)：美国AB Sciex公司产品，配有N2激光器，激光波长337 nm；DHB、THAP、ISL、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、棉籽糖：美国Sigma公司产品；甘露醇、精氨酸、苏氨酸-亮氨酸二肽：北京化工厂产品；乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国Fisher公司产品；实验用水(电阻率18.2 MΩ/cm)：由Milli-Q超纯水机制备，美国Millipore公司产品。

图1 ISL、DHB和THAP的结构图Fig.1 Structures of ISL, DHB and THAP

1.2 MALDI基质溶液和样品的制备

1.2.1 基质溶液的制备 THAP和DHB溶解在乙腈-水溶液中(1∶1，V/V)，浓度均为0.5 mmol/L；ISL溶解在甲醇中，其浓度为0.05 mmol/L。在MALDI分析前，所有被分析物均用去离子水溶解和稀释。

1.2.2 样品的制备 参照文献[15]，采用dried-droplet法制备样品。首先将0.5 μL的样品溶液点在不锈钢靶上，然后立即将0.5 μL的ISL基质溶液滴到样品上，于空气中干燥，结晶后进行质谱分析。

1.3 MALDI-TOF MS条件

正离子反射模式，加速电压20 kV，延迟时间100 ns，激光频率3 Hz。外标法进行校正，校正液包括棉籽糖(m/z527.158 26)和CHCA(m/z

190.050 4)。获得的质谱图来源于50个激光点。

2 结果与讨论

2.1 重复性

作为一种适宜的基质，能与样品的混合物在样品靶上形成均匀的斑点是获得较好的点和点重现性的前提。在使用dried-droplet方法分析甘露醇时，样品与DHB、THAP、ISL基质形成的结晶层的形态学差异示于图2。由图2可见，DHB与样品在点的边缘形成了针状结晶，THAP在样品的表面形成了网状结晶，而ISL与样品形成了均匀的表面，没有大的簇。以分析0.2 g/L精氨酸为例，ISL为基质时所获得的RSD值不超过10%，而THAP和DHB为基质时所获得的RSD值均远远大于10%，这表明ISL能提供良好的点和点的重复性，可为进一步的定量研究奠定基础。实验中，从30个不同位置获得的离子峰的相对强度和平均标准偏差(RSD)示于图3。

图2 2 mmol/L甘露醇与DHB(a)、THAP(b)和ISL(c)基质点样形成结晶后的照片Fig.2 Images of sample preparation using DHB (a), THAP (b) and ISL (c) as the matrices

注：右侧白色、灰色和黑色棒状图分别代表使用ISL、DHB和THAP为基质所获得的RSD值图3 使用ISL、DHB和THAP为基质的30个不同激光照射点所获得的归一化的精氨酸[M+H]+离子强度Fig.3 Plot of normalized [M+H]+ ion intensities yielded from 30 different positions on a sample of arginine with ISL in comparison to traditional DHB matrix and THAP matrix

2.2 耐盐和基体组分的能力

在低含量的盐类或基体组分存在的条件下，一般有机基质解吸/离子化的能力会大大降低，因此，有必要考察ISL作为基质的耐盐和基体组分的能力。在盐存在的条件下，以0.05 mmol/L ISL为基质的0.2 g/L精氨酸的MALDI质谱图示于图4。其中，图4a和图4b分别为1 mol/L和2 mol/L氯化钠存在下，以ISL为基质的精氨酸的MALDI质谱图。由图可见，虽然在高浓度氯化钠的条件下，离子信号强度和S/N有所降低，但在2 mol/L氯化钠存在下仍可以检测到精氨酸。图4c是以ISL为基质，1 mol/L脲素存在下的精氨酸的MALDI质谱图，图中获得了较好的精氨酸离子信号。在2 mol/L脲素存在的条件下，尽管S/N明显降低，但仍可以检测到精氨酸，其质谱图示于图4d。然而，当使用相同浓度的DHB和THAP为基质时，在1 mol/L 氯化钠或脲素存在下观察不到样品信号。由以上结果可以推测，ISL基质适用于高浓度盐或高浓度基体实际样品的分析。

注：a.1 mol/L氯化钠；b.2 mol/L氯化钠；c.1 mol/L脲素；d.2 mol/L脲素图4 盐存在下，以0.05 mmol/L ISL为基质的0.2 g/L精氨酸的MALDI质谱图Fig.4 MALDI mass spectra of 0.2 g/L arginine ([M+H]+，175 u) using 0.05 mmol/L ISL as matrix in the presence of saline material

2.3 低浓度的ISL、DHB和THAP作为基质分析小分子物质的结果比较

分别以0.05 mmol/L ISL、0.5 mmol/L DHB和0.5 mmol/L THAP为基质分析精氨酸、甘露醇和苏氨酸-亮氨酸二肽，结果示于图5。对以这3种物质为基质所获得的分辨率进行了比较，结果列于表1。通过比较发现：以0.05 mmol/L的ISL为基质分析小分子，可以获得无干扰的质谱图；而以DHB和THAP为基质时，干扰峰很多，对未知物而言，根本无法区分目标化合物；表1中的数据表明，以ISL为基质获得的分辨率高于以DHB和THAP为基质获得的分辨率。因此，低浓度的ISL更适合作为分析小分子的基质。

表1 以ISL、DHB和THAP为基质分析精氨酸、甘露醇和苏氨酸-亮氨酸二肽所获得的分辨率

注：a.精氨酸，DHB基质；b.精氨酸，THAP基质；c.精氨酸，ISL基质；d.甘露醇，DHB基质； e.甘露醇，THAP基质；f.甘露醇，ISL基质；g.苏氨酸-亮氨酸二肽，DHB基质； h.苏氨酸-亮氨酸二肽，THAP基质；i.苏氨酸-亮氨酸二肽，ISL基质图5 使用3种不同基质分析3个物质所获得的MALDI质谱图Fig.5 MALDI mass spectra of 0.2 g/L arginine, 2 mmol/L mannitol, and 1 g/L Thr-Leu using DHB, THAP and ISL as matrices

3 结论

本工作采用低浓度的异甘草素(ISL，0.05 mmol/L)作为MALDI-TOF MS分析小分子物质的基质，对精氨酸、甘露醇和苏氨酸-亮氨酸二肽等小分子物质进行分析，并与常用的有机基质DHB和THAP比较。结果表明，ISL作为MALDI-TOF MS分析小分子物质的基质具有点和点的重复性好、耐盐性好、无基质干扰等优点，这可为有机基质在小分子的MALDI-TOF MS分析中的应用开辟新的窗口。

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Low Concentration of Isoliquirigenin as a Matrix for the Analysis of Small Molecules by MALDI-TOF MS

HUANG Liang1, YANG Hong-mei1,2, SHI Lei3, LIU Shu-ying1,2

(1.JilinGinsengAcademy,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China;2.ChangchunCenterofMassSpectrometry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China;3.ChinaNuclearEngineeringGroupCo.Ltd.,Beijing100037,China)

Small molecules, including arginine, mannitol and dipeptide were analyzed by matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) using a low concentration of isoliquirigenin (ISL, 0.05 mmol/L) as a matrix. In comparison with 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP), ISL exhibited outstanding matrix properties as follows: 1) higher homogeneity of crystallization thus allowing automatic data acquisition; 2) better spectral quality in terms of resolution and signal to noise ratio (S/N); 3) better salt tolerance. The study has an important role in organic compounds as matrix for analyzing small molecules, and can open up a new prospect.

isoliquirigenin (ISL); matrix; matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS); small molecules

2014-05-07;

2014-11-13

国家自然科学青年基金(21305135、21175127)资助

黄 良(1989—)，女(汉族)，江西人，硕士研究生，从事中药化学研究。E-mail: huangliang0827@163.com

杨洪梅(1980—)，女(汉族)，黑龙江人，副研究员，从事生物质谱研究。E-mail: yanghm0327@sina.cn 刘淑莹(1943—)，女(汉族)，黑龙江人，研究员，从事中药化学和有机质谱学研究。E-mail: liusy01@ccucm.edu.cn

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0243-06

10.7538/zpxb.2015.36.03.0243