G－CSF对东莨菪碱痴呆模型大鼠认知及ChAT表达的影响

丁 明，张 迅，王 威，迟 蕾

术后认知功能障碍 （postoperation cognitive dysfunction，POCD）是指麻醉手术后出现的一种焦虑、精神错乱、人格改变及记忆受损的中枢神经系统并发症，并且老年患者发生率较高。研究推测，脑中特定区域的胆碱能神经通路参与了老年人POCD的 发 生［1］。 粒 细 胞 集 落 刺 激 因 子 （granulocyte colony stimulating factor，G－CSF） 能够诱导干细胞增殖、分化，促进神经营养因子释放，从而加强神经芽殖、突触发生、神经传递以及神经递质释放［2］，研究表明，G－CSF在脑缺血动物模型中具有神经保护作用［3］。常作为麻醉前用药的东莨菪碱，因其具有抗胆碱作用，常被用来建立研究抗痴呆药物的动物模型。本实验应用东莨菪碱致大鼠认知障碍动物模型，进一步研究G－CSF对抗胆碱药引起的认知障碍的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 氢溴酸东莨菪碱（上海禾丰制药有限公司，批号130401）；重组人粒细胞集落刺激因子 （山东齐鲁制药， 批号201305019TC）；PV－9001兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；生物素化抗鼠IgG（武汉，博士德公司）；鼠抗ChAT多克隆抗体（武汉，博士德公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 实验动物选择及分组 10月龄的Wistar雄性大鼠24只 （山东济宁鲁抗实验动物中心提供），体质量（480±30）g，分笼饲养一周适应环境，自由摄食摄水。实验前对大鼠使用Morris水迷宫（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）进行水迷宫适应性训练两次。随机分三组：空白组（N组），东莨菪碱组（S组）和G－CSF干预组（G组），每组8只。N组腹腔注射生理盐水1 ml，S组腹腔注射氢溴酸东莨菪碱1 mg／kg，G组腹腔注射氢溴酸东莨菪碱1 mg／kg后皮下注射G－CSF 50 μg／kg，连续5 d。

1.3 检测指标

1.3.1 行为学测试 于每天给药3 h后进行Morris水迷宫测试，测定大鼠从入水到爬上潜在平台的时间（潜伏期）和总游泳路程。测试两次取其平均值，两次测试间隔1 h。

1.3.2 形态学检查 ①实验动物的灌注与取材大鼠末次水迷宫测试后，腹腔注射10%的水合氯醛3 ml／kg麻醉后暴露心脏，左心室内注射1%肝素2 ml后经左心室进行主动脉插管，丝线固定后右心耳处剪口，以400 ml生理盐水快速冲洗血管，待肝脏颜色变为苍白色并且无血液流出时，用4℃4%多聚甲醛灌注2 h，肢体尾部变硬后断头取脑，置入4%多聚甲醛中再固定24 h。将脑标本乙醇系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片机切片，制成4 μm厚连续切片。②海马区胆碱乙酰转移酶（ChAT）表达的测定 用免疫组化SP法测定ChAT的表达。镜下观察细胞核及细胞质染色，用计算机图像系统分析摄片，测出阳性细胞个数。

2 结 果

2.1 各组潜伏期天数比较 N、S、G三组不同天数间经单因素方差分析，结果显示潜伏期每一组不同天数间的差异均有统计学意义。进一步两两比较显示，每一组中第3天与第1天间的差异均有统计学意义（P＜0.05）；每一组中第5天与第1天见的差异均有统计学意义（P＜0.05），潜伏期均较第1天缩短。见表1。

表1 各组大鼠不同天数潜伏期（s）的比较（±s，n＝8）

表1 各组大鼠不同天数潜伏期（s）的比较（±s，n＝8）

注：与第1天比较，ΔP＜0.05

组别 第1天 第3天 第5天 F P N组 84.50±7.43 41.50±6.95Δ 17.25±4.80Δ 220.067 0.000Δ S组 81.75±7.98 65.50±6.99Δ 40.75±6.61Δ 65.520 0.000Δ G组 85.13±7.26 45.38±5.04Δ 28.25±5.75Δ 183.780 0.000Δ F 0.451 32.509 33.251 － －P 0.643 0.000Δ 0.000Δ － －

2.2 各组游泳距离各天之间比较 N、S、G三组不同天数间经单因素方差分析，结果显示游泳距离的每一组不同天数间的差异均有统计学意义。进一步两两比较显示，每一组中第3天与第1天间的差异均有统计学意义（P＜0.05）；每一组中第5天与第1天见的差异均有统计学意义（P＜0.05），游泳距离均较第1天缩短。见表2。

表2 各组大鼠不同天数游泳距离（cm）的比较（±s，n＝8）

表2 各组大鼠不同天数游泳距离（cm）的比较（±s，n＝8）

注：与第1天比较，ΔP＜0.05

组别 第1天 第3天 第5天 F P N组 1501.13±168.71 858.00±171.19Δ 356.63±91.28Δ 119.508 0.000Δ S组 1492.88±193.00 1126.00±170.94Δ 769.50±118.89Δ 38.785 0.000Δ G组 1665.50±273.93 915.25±164.90Δ 582.00±157.55Δ 58.179 0.000Δ F 1.613 5.577 21.689 － －P 0.223 0.011Δ 0.000Δ － －

2.3 各组ChAT阳性细胞个数的比较 ChAT阳性细胞个数在不同组间经单因素方差分析后，结果显示不同组间的差异均有统计学意义 （F＝43.049，P＝0.000＜0.05）， 进一步两两比较可得，N组与S组，G组与S组间ChAT阳性细胞个数的差异均有统计学意义，且细胞个数均低于S组。见表3。经过统计学检验，本实验所有组间均符合方差齐性。

表3 各组ChAT阳性细胞个数比较（±s）

表3 各组ChAT阳性细胞个数比较（±s）

注：与S组比较，ΔP＜0.05

S组 8 32.63±4.37 G组 8 22.75±4.03Δ组别 样本例数 个数 F P N组 8 14.75±3.06Δ 43.049 0.000Δ

3 讨 论

本实验选用成年雄性大鼠，首先因为老年大鼠胆碱能功能减退；其次，研究发现雌激素可以增强胆碱能神经元的功能、促进神经细胞生长并改善认知功能等［4］。

东莨菪碱是常见的抗胆碱药，可以抑制中枢胆碱能通路功能。作为麻醉前用药，其抑制腺体分泌作用强于阿托品等抗胆碱药。东莨菪碱致大鼠认知功能获得性障碍模型是一种较为成熟的研究抗痴呆药物的动物模型。本实验结果S组和N组相比，说明了该动物模型造模理想，模拟了麻醉和手术后胆碱能系统功能改变。

Morris水迷宫实验是测试大鼠空间学习记忆能力的常用检测方法，潜伏期和游泳距离可以反映大鼠认知功能的变化。本实验结果表明，G－CSF可以改善东莨菪碱引起的空间学习记忆障碍，表现为G组第5天潜伏期和游泳距离较S组短。

G－CSF是一种骨髓干细胞动员剂，可以促进干细胞增殖并通过外周血向受损部位迁移［5］，可以促进神经营养因子的合成和分泌［6］以及修复部分受损的神经功能。本实验结果G组ChAT阳性细胞个数高于S组，说明G－CSF在一定程度上修复了东莨菪碱造成的中枢胆碱能通路功能的损伤。

综上所述，东莨菪碱致认知障碍的大鼠应用G－CSF干预治疗，可以通过上调ChAT的表达，修复受损的胆碱能通路功能，促进大鼠学习和记忆等功能障碍的恢复。其改善认知功能的其他机制还需进一步研究。

［1］Ontl T，Xing Y，Bai L，et al.Development and aging of N－methyl－D－aspartate receptor expression in the prefrontal／frontal cortex of mice［J］.Neuroscience，2004，123（2）：467－479.

［2］Shyu WC，Lin SZ，Yang HI，et al.Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colony－stimulating factor－stimulated stem cells［J］.Circulation，2004，110（13）：1847－1854.

［3］Six I，Gasan G，Mura E，et al.Beneficial effect of pharmacological mobilization of bone marrow in experimental cerebral ischemia［J］.European Journal of Pharmacology，2003，458（3）：327－328.

［4］Dubal DB，Kashon ML，Pettigrew LC，et al.Estradiol protects against ischemic injury［J］.Journal of Cerebral Blood Flow＆Metabolism，1998，18（11）：1253－1258.

［5］Yung MC，Hsu CC，Kang CY，et al.A potential for granulocytecolony stimulating factor for use as a prophylactic agent for heatstroke in rats［J］.European Journal of Pharmacology，2011，661（1）：109－117.

［6］Ogawa A，Maeguchi M，Uchida Y，et al.Effect of tazarotene，an acetylenic retinoid，on human dermal fibroblast［J］.Japanese Journal of Pharmacology，1998，76（3）：317－319.