索拉非尼诱导人多发性骨髓瘤U266 细胞凋亡及其机制研究

李 璇，吴 超，肖佩玲，邓 坦

（湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院，长沙 410005）

多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是发生于B淋巴细胞的恶性浆细胞肿瘤，好发于中老年，但近年发病率有增高及发病年龄有提前趋势。目前临床常用药物对 MM 的治疗效果并不理想，其特效化疗药物沙利度胺抗肿瘤机制之一为通过作用于 VEGF 受体达到抑制肿瘤血管生成，但完全缓解率较低且易复发。而且，沙利度胺的多项副反应制约了它的进一步应用，如强烈的致畸作用、周围神经病变、血栓等。所以亟需挖掘新的安全有效的药物治疗 MM 是目前的关键。索拉非尼（Sorafenib）是一种多靶点分子靶向药物，目前广泛应用于晚期肝癌及肾癌治疗，它的作用靶点包括 RAF 激酶、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR－β、c-Kit 和 FLT-3等，它可通过抑制 VEGF 受体和 PDGFR 而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长［1］。但索拉非尼对 MM 的作用及其机制目前尚不清楚，本研究尝试探索不同浓度索拉非尼对 MM 细胞 U266 的增殖、凋亡等作用的影响，并进一步检测其影响相关信号通路关键分子如 VEGFR、PDGFR 的表达水平，以达到从细胞层面了解索拉非尼治疗 MM 的可行性，为后续更多相关机制及临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器及细胞株索拉非尼（Sorafenib）是德国拜耳公司惠赠。RPMI 1640 培养液和胎牛血清购于美国 Gibco 公司。二甲基亚砜（DMSO）由湖南省人民医院临床研究所提供。噻唑蓝（MTT）、细胞培养板（96孔）购于碧云天生物技术研究所。AnnexinV-FITC/PI购于北京创根胜泰科技有限公司。逆转录试剂盒购于Fermentas 公司。SYBDREEN PCR MIX 购于 ABI 公司。DL2000 DNA Marker、Taq 酶、Trizol、DEPC、6*loading buffer、dNTP 购于 Genstar 公司。Q-PCR 引物在上海生工生物公司订制。羊抗鼠 VEGFR-3、PDGFR-β 单克隆抗体购于美国 Proteintech 公司。流式细胞仪 ACEA NovoCyte TM 购于北京艾格斯生物有限公司。荧光定量 PCR 仪 PIKO REAL 96、SuperECL PLUS 超敏发光液购于美国 Thermo 公司。人多发性骨髓瘤细胞 U266 细胞株购于上海美轩生物科技有限公司。

1.2 细胞培养人多发性骨髓瘤细胞 U266 于10 %灭活胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中培养，在37 ℃、5 %CO2 湿化培养箱进行培养，每1 天换液一次，隔2-3 天传代一次。实验选取对数生长期的细胞进行。

1.3 MTT 检测细胞增值抑制率分别取100 μL 细胞（5×103 /mL）接种于九十六孔板中。将索拉非尼的药物终浓度配成0、1.5、3.0、6.0、12、15、20 μmol/L，用不加细胞及细胞培养基作为空白和阴性对照组，每组设10 个平行孔（每组边缘两孔用细胞培养基配平，减少细胞误差）。置于培养箱内培养24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/ml MTT 10 μL，继续孵育4 h 后离心，除去上清后各加入100 μL DMSO，振荡器上振荡5 min，使紫色结晶物充分溶解，然后于酶标仪570 nm 波长处检测各孔的吸光度（OD）值。

其中，细胞板计数及细胞抑制率公式如下：

细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104 个/mL（压线细胞只记左侧和上方）

细胞抑制率=［1-（实验组OD 值-空白对照组OD值）/阴性对照组OD 值-空白对照组OD 值］×100%

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率按照 Annexin-V FITC/PI 双染试剂盒的说明操作，依照 MTT 中索拉非尼的药物浓度（除去高浓度20 umol/L 组）孵育细胞48 h后用 PBS 重悬细胞，取5×105 细胞悬液离心后去除上清，再加入500 μL 的1×结合缓冲液混匀。接着依次加入5 μL Annexin-V FITC 及10 μLPI，充分摇匀。于室温下避光反应10 min。最后，在30 min 之内置于流式细胞仪中检测。

1.5 Q-PCR 检测目的基因表达Human-VEGFR2（Forward：5'-GAGTGGCAGTGAGCAAAGGG-3'，Reverse：5'-CATAGACATAAATGACCGAGGC-3'）；Human-VEGFR3（Forward：5'-TGCCTGCGACTGTGGCTCTG-3'，Reverse：5'-CCCGTGTCCTCGCTGTCCTTGT-3'）；Human-PDGFR（Forward：5'-CCGAACATCATCTGGTCTGCC-3'，Reverse：5'-CAAACTCCTGCTCCTCCTCCC-3'）；Human-C-KIT（Forward：5'-GCTCTGCTTCTGTACTGCCA-3'，Reverse：5'-GGTGTGGGGATGGATTTGCT-3）；Forward：5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'，Reverse：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'（β-actin）。采用Trizol 提取细胞总 RNA，运用分光光度计测取在260 和280 nm 处的吸光度值A，选取A260 计算出 RNA 的浓度用于反转录（RNA 浓度=A260×稀释倍数×40 ng/ml）。逆转录按试剂盒说明进行操作。PCR 反应总体积为30 μL，包括 cDNA 1 ul，上下游引物各0.5 μL，PCR H2O 13 μL，2× SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。

扩增程序如下：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，59 ℃退火，72 ℃延伸，共40 个循环，每个循环1 min。取5 ul PCR 扩增产物上样于2 %的琼脂糖凝胶，在170 V 下恒压电泳，待溴酚蓝前沿迁移至凝胶总长2/3 处停止电泳，凝胶成像系统下观察。将目的基因结果于 β-actin 的灰度比值进行半定量分析。

1.6 Western-blot 检测目的蛋白表达让不同浓度索拉非尼孵育多发性骨髓瘤细胞 U266 48 h 后 PBS 重悬细胞去上清，然后按蛋白抽提试剂盒说明提取总蛋白。用 BCA 法测定蛋白浓度，根据蛋白定量结果，第一孔加入 maker，其它每孔用 5×loading buffer 配平总量为20 μg 上样于120 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝至凝胶底部时，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。用 1×TBST 配制5 % 脱脂奶粉液室温封闭2 h 后，加入一抗4 ℃ 摇床孵育过夜，用 TBST 洗膜3 次后，加二抗室温孵育1 h 。再用 TBST 洗膜3 次，ECL 显色曝光，目的蛋白条带的表达情况由 IPP 光密度分析软件分析。

1.7 统计学处理用 SPSS18.0 软件包进行t 检验以及直线回归，以双侧α=0.05 为检验水准。数据均以表示。

2 结果

2.1 索拉非尼对多发性骨髓瘤细胞 U266 增殖影响

MTT 检测结果显示：索拉非尼对多发性骨髓瘤细胞U266 具有较明显的抑制作用。跟对照组相比，除了小于3 μmol/L（P>0.05）以外，各实验组抑制率均有统计学差异（P﹤0.05）。并且，抑制率随药物浓度递增而增高，表明了索拉非尼对骨髓瘤细胞 U266 的抑制作用呈现浓度依赖性（r=0.537）。此外，同一浓度在24、48、72 h 不同时间段的细胞抑制率也存在显著统计学差异（P﹤0.05），随孵育时间延长抑制率随之增高，表明索拉非尼对骨髓瘤细胞 U266 的抑制作用呈现时间依赖性（r=0.392）（图1）。

图1 .索拉非尼对多发性骨髓瘤细胞 U266 增殖影响

2.2 索拉非尼对多发性骨髓瘤细胞U266 凋亡影响由图2 可见，右上象限表示晚期凋亡细胞百分数，右下象限表示早期凋亡细胞百分数。检测结果表明索拉菲尼孵育 U266 细胞株48 h 后，除了小于3 μmol/L（P>0.05）以外，其它各实验组凋亡率均有统计学差异（P﹤0.05）（图2）。

图2 .索拉非尼处理U266 48h细胞流式细胞仪检测结果

2.3 索拉非尼对多发性骨髓瘤细胞 U266 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β及 c-Kit 的影响不同浓度索拉非尼处理多发性骨髓瘤细胞 U266 48 h 后检测各组 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β 及 c-Kit 的 mRNA表达及 VEGFR-3、PDGFR-β 蛋白表达情况。结果显示：各实验组与对照组比较，VEGFR-2、VEGFR-3 及PDGFR-β 的 mRNA 的表达均随索拉非尼浓度的增加而减弱，尤其是 VEGFR-3 和 PDGFR-β（图3）。其中，c-Kit 的表达不呈浓度依赖性，但表达也相对减弱。同时，Western-blot 检测 VEGFR-3 与 PDGFR-β 的蛋白表达结果与 Q-PCR 结论一致（图4）。

图3 .索拉非尼处理48 h对多发性骨髓瘤细胞 U266 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β 及 c-Kit 的影响

图4 .索拉非尼处理48 h U266 VEGFR3，VEGFR2，PDGFR-β，c-Kit 表达

3 讨论

多发性骨髓瘤是血液系统中常见恶性肿瘤之一，目前治疗方案尚不理想。虽然，化疗联合自体造血细胞移植以及有效药物如硼替佐米、来那度胺等临床应用，使患者近期缓解率以及生存率有所缓解，但是远期临床耐药和复发仍然是临床治疗失败的主要原因。因此亟需挖掘一种有效安全的药物来治疗多发性骨髓瘤。

索拉菲尼（Sorafenib，多吉美）是二芳基脲类的新型药物之一，由 Onyx 和 Bayer 公司共同研制。其中，被美国食品和药物管理局（FDA）于2005 年12 月批准用于晚期肾细胞癌和肝细胞癌［2］的治疗。而且，索拉菲尼是第一个口服的多激酶抑制剂，主要的作用靶点是 MAPK途径［3］，同时也是被证实的唯一可延长进展和总生存时间（OS）的靶向药物［4］。多发性骨髓瘤予以索拉菲尼治疗一直是研究重点［5］，在 MM 细胞和基质细胞之间的相互作用中，骨髓微环境提供了一些必要的生存信号，如细胞因子，VEGF［6］，IL-6［7］以及 IGF-1［8］。而上述的细胞因子均可激活 Ras/ Raf 的 MEK / ERK 途径，这也已经被证实用于骨髓瘤细胞的存活［9］。因此，本研究认为深入挖掘索拉菲尼对多发性骨髓瘤的作用机制，可为临床提高 MM 的治疗及预后的评估提供分子层面的依据。

本研究采用了 MTT 法检测了索拉菲尼对人多发性骨髓瘤细胞 U266 细胞株的增值抑制作用，结果发现索拉菲尼可抑制 U266 细胞株的增值，且呈现一定范围内的浓度-时间依赖性。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果表明索拉菲尼组凋亡率明显高于对照组，更进一步证实索拉菲尼可诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡［10］。运用 Q-PCR 和 Western-blot 检测法在基因和蛋白水平都证实了索拉菲尼对人多发性骨髓瘤细胞 U266的抑制作用。但是，索拉菲尼具体的促人多发性骨髓瘤细胞 U266 凋亡机制尚有待于进一步研究。

本研究结果表明，索拉菲尼对人多发性骨髓瘤细胞 U266 有抑制增值和诱导凋亡作用。凋亡的主要机制可能是通过激活凋亡信号通路，抑制 VEGFR-3 和PDGFR-β 的表达从而诱导细胞凋亡作用。

［1］ Wilhelm SM, Adnane L, Newell P, et al., Preclinical overview of sorafenib, a multikinase inhibitor that targets both Raf and VEGF and PDGF receptor tyrosine kinase signaling［J］.Mol Cancer Ther, 2008,7(10): 3129-3140.

［2］ Hasskarl J.Sorafenib: targeting multiple tyrosine kinases in cancer［J］.Recent Results Cancer Res, 2014.201: 145-164.

［3］ Ramírez-Labrada A, López-Royuela N, Jarauta V, et al.Two death pathways induced by sorafenib in myeloma cells: Puma-mediated apoptosis and necroptosis［J］.Clin Transl Oncol, 2015.17(2): 121-132.

［4］ Arizumi T, Ueshima K, Iwanishi M, et al.Real-Life Clinical Practice with Sorafenib in Advanced Hepatocellular Carcinoma: A Single-Center Experience Second Analysis［J］.Dig Dis, 2015, 33(6): 728-734.

［5］ Ramakrishnan V, Timm M, Haug JL, et al.Sorafenib, a multikinase inhibitor, is effective in vitro against non-Hodgkin lymphoma and synergizes with the mTOR inhibitor rapamycin［J］.Am J Hematol, 2012,87(3): 277-283.

［6］ Le Gouill S, Podar K, Amiot M, et al.VEGF induces Mcl-1 up-regulation and protects multiple myeloma cells against apoptosis［J］.Blood,2004.104(9): 2886-2892

［7］ Ogata A, Chauhan D, Teoh G, et al.IL-6 triggers cell growth via the Ras-dependent mitogen-activated protein kinase cascade［J］.J Immunol, 1997, 159(5): 2212-2221.

［8］ Ferlin M, Noraz N, Hertogh C, et al.Insulin-like growth factor induces the survival and proliferation of myeloma cells through an interleukin-6-independent transduction pathway［J］.Br J Haematol, 2000, 111(2):626-634.

［9］ Platanias LC.Map kinase signaling pathways and hematologic malignancies［J］.Blood, 2003, 101(12): 4667-4679.

［10］ Ramakrishnan V, Timm M, Haug JL, et al.Sorafenib, a dual Raf kinase/vascular endothelial growth factor receptor inhibitor has significant anti-myeloma activity and synergizes with common anti-myeloma drugs［J］.Oncogene, 2010.29(8): 1190-1202.