2型糖尿病大鼠早期血清cTnI水平与心功能的变化*

尹茂山，许淑红，牟艳玲(济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东济南5000;山东省医学科学院药物研究所，山东济南5006;中国药科大学，江苏南京98)

2型糖尿病大鼠早期血清cTnI水平与心功能的变化*

尹茂山1，2，许淑红3，牟艳玲2△
(1济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东济南250200;2山东省医学科学院药物研究所，山东济南250062;3中国药科大学，江苏南京211198)

［摘要］目的:研究2型糖尿病大鼠早期血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)的水平及心功能变化，探讨早期2型糖尿病大鼠血清cTnI水平与糖尿病心肌损伤发生发展之间的关系，明确cTnI在糖尿病心肌病发生发展中的作用。方法:通过高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型，实验将大鼠分为正常对照组、糖尿病2周模型组及4周模型组，超声心动图检测心功能相关指标，血清检测空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰岛素(FINS)及cTnI水平，HE染色法观察心肌病理结构变化，Western blot法检测心肌cTnI蛋白表达变化，通过上述指标变化分析2型糖尿病大鼠早期血清cTnI与大鼠心功能改变之间的关系。结果:与正常组比较，2型糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低;糖尿病大鼠4周模型组与2周模型组相比较，TC、TG、LDL-C水平升高更明显，HDL-C水平降低更显著(P＜0.01) ;显微镜下糖尿病组大鼠心肌可见局灶性心肌细胞变性、坏死;糖尿病组大鼠相对于正常对照组血清及心肌cTnI表达显著增加(P＜0.01)，且4周模型组比2周模型组增加更明显。结论:糖尿病大鼠早期即出现cTnI水平升高和心功能改变，有望为糖尿病心肌病的早期诊断和治疗提供理论依据。

［关键词］心肌肌钙蛋白I;心功能; 2型糖尿病;心肌损伤

随着人们生活水平的提高以及肥胖发生率的增加，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，心血管并发症是DM患者死亡的主要原因。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)最早于1972年由Rubler等提出［1］，目前，其作为糖尿病独立的并发症逐渐被肯定，并被临床医生所重视。糖尿病心肌病的诊断和治疗的研究也在日益深入，其中，对于血清学相关指标在本病诊断价值中的研究也越来越多。心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)作为心肌收缩的调节蛋白，其在心肌疾病诊断中的研究价值相对较高。对于早期糖尿病患者体内cTnI的变化情况研究较少，本文拟通过对早期2型糖尿病大鼠模型心功能变化及cTnI表达变化的规律的研究，为糖尿病心肌病的预防、早期诊断及治疗提供理论基础。

材料和方法

1实验动物及模型建立

健康雄性SD大鼠30只，SPF级，体重150～180 g，购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心。大鼠适应性喂养1周后，按体重均衡的原则随机分为正常对照组10只，糖尿病模型组20只。对照组始终饲以普通饮食，模型组采用高脂流质(猪油30%，胆固醇2.5%，脱氧胆酸钠1%，常规饲料66.5%)灌胃，2组动物均自由饮水。5周后，模型组大鼠禁食12 h，颈静脉窦取血检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)等生化指标，确定形成高脂模型，诱导出大鼠胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)状态，联合链脲佐菌素造模。模型组大鼠一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(30 mg/kg; pH 4.5柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，4℃配制，现用现配)，对照组正常大鼠注射同体积柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。造模后72 h尾静脉采血检测空腹血糖值(fasting blood glucose，FBG)，以FBG≥11.1 mmol/L、胰岛素敏感指数降低为糖尿病大鼠模型建立成功。造模成功大鼠随机分为2周模型组和4周模型组，继续高脂饮食灌胃。对照组继续以常规饲料喂养4周。

2材料与试剂

链脲佐菌素和戊巴比妥钠(Sigma) ;血糖试纸(强生中国医疗器材有限公司) ; TG试剂盒、TC试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)试剂盒和高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)试剂盒(四川迈克生物科技股份有限公司) ;胰岛素(insulin，INS)试剂盒、cTnI试剂盒(Lengton) ;医用超声耦合剂(上海申风医疗保健有限公司)。

3实验方法

3.1空腹血糖及胰岛素检测高脂灌胃5周后，大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素后72 h，禁食12 h，颈静脉窦取血，离心分离血清，检测空腹血糖及胰岛素(fasting insulin，FINS)水平，计算胰岛素敏感指数(insulin sensitive index，ISI)，检测胰岛素敏感性变化，公式为ISI=ln［1/(FINS×FBG)］。

3.2超声心动图分别于糖尿病造模2周末、4周末，禁食禁水12 h，用浓度为0.6%戊巴比妥钠(30 mg/kg)按照5 mL/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，固定于手术台上，使用小动物超声成像系统Vevo 2100(维胜中国)检测左心室舒张末期内径(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)、左心室收缩末期内径(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、左室舒张末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole，LVPWd)、左室收缩末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in systole，LVPWs)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室质量(left ventricular mass，LV mass)。

3.3标本收集造模结束后，大鼠麻醉，仰位固定，开腹，腹主动脉取血，每只5 mL，3 000 r/min离心10分钟，取上清，分装，－20℃保存待测。生化仪检测TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。迅速取出心脏，用冷生理盐水洗净，滤纸吸干，剔除血管、脂肪等非心肌组织，称心脏重量(heart weight，HW)和左心室(含室间隔)重量(left ventricular weight，LVW)，并计算心脏(左心)指数=心脏(左心室)重量(mg)/体重(g)。分离的左心室再分为2部分:一部分用4%多聚甲醛固定，经脱水、透明、包埋，制成心肌组织蜡块;另一部分置于EP管，于液氮中保存待用。

3.4ELISA检测cTnI水平采用ELISA试剂盒检测血清cTnI水平。

3.5HE染色取石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素染色10 min，流水稍洗，体积分数1%的盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟，伊红染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片。Eclipse TE 2000-S荧光显微镜观察心肌组织形态学的改变。

3.6Western blot实验制备心肌组织匀浆，每20 mg组织加入100～200 μL含1 mmol/L PMSF的裂解液，4℃下14 000×g离心10 min，取匀浆上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。20～50 μg总蛋白上样量以浓度为8%的凝胶电泳进行分离。冰浴下恒流(300 mA)湿法转膜2 h，体积分数5%的脱脂奶粉封闭1 h后与相应Ⅰ抗4℃共孵育过夜。TBST洗液洗涤，与辣根过氧化物标记的II抗共孵育，用增强型化学发光试剂进行显色，并利用灰度分析软件定量分析。

4统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，组间差异比较采用方差分析及t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1大鼠DM模型建立情况

实验期间，正常对照组大鼠状态良好、健壮、皮毛油亮有光泽，自主活动正常，对外界反应灵敏。相比较，DM组大鼠逐渐表现体重降低，精神萎靡，皮毛无光泽，腥臊臭味加重等。造模成功大鼠18只，成功率为90%。

2造模后各组FBG、FINS和ISI情况

糖尿病模型组大鼠与对照组大鼠比较血清FBG 和FINS显著升高，ISI下降，有显著差异(P＜0.01)，表明2型糖尿病大鼠造模成功，见表1。

表1　造模后各组大鼠基本情况比较Table 1.The general characteristics of the rats after DM modeling (Mean±SD)

3心脏超声检测结果

与正常对照组比较，糖尿病模型组(2周、4周)大鼠的LVIDd及LVIDs值显著增大(P＜0.05)，LVPWd及LVPWs不同程度增厚(P＜0.05)，FS、LVEF及LV mass值显著降低(P＜0.05)，LV mass/body weight值增高; 4周模型组与2周模型组比较，4周模型组的LVPWd及LVPWs增厚程度更显著(P＜0.05)，FS、LVEF和LV mass显著降低(P＜0.05)，LV mass/body weight值明显增高，见图1、表2。

Figure 1.M-mode echocardiography of cardiac tissue from each group.图1各组大鼠M-mode超声心动图代表图像

表2　早期DM大鼠左室结构参数及功能比较Table 2.The changes of the structural and functional parameters in the left ventricle of the early DM rats (Mean±SD)

4血生化指标检测结果

与正常对照组比较，模型组(2周、4周)大鼠血清中FBG、TG、TC和LDL-C明显升高(P＜0.05)。而4周DM模型组与2周DM模型组相比较，大鼠血清TG含量略有升高，HDL-C略有降低，二者之间比较差异不显著，FBG、TC和LDL-C继续升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3　早期DM大鼠血生化指标水平比较Table 3.The changes of the biochemical parameters in the early DM rats with different treatments (Mean±SD)

5大鼠体重及心脏各指标的测定结果

与正常对照组相比，4周DM组大鼠体重明显降低(P＜0.01)，心脏及左心室重量变化不明显;但心脏指数和左心室指数均高于对照组(P＜0.05) ; 4周DM组与2周DM组比较，左心室指数明显升高(P＜0.05)，见表4。

6大鼠心肌组织病理观察结果

正常对照组大鼠心肌纹理清晰，心肌组织细胞排列整齐，细胞核均匀分布，无变性、坏死等病理结构改变。DM组大鼠心肌细胞胞浆丰富，细胞核由正常的圆形或椭圆形变为长杆状，排列紊乱，2周模型组心外膜下心肌炎细胞浸润，心内膜出现心肌细胞坏死迹象，4周模型组心外膜下心肌坏死，少量成纤维细胞增生，心内膜下出现少量心肌细胞变性、坏死，4周模型组较2周模型组心肌组织病理变化更明显，见图2。

表4　早期DM大鼠心脏取材相关指标测定Table 4.The parameters of the heart and body weight of the early DM rats with different treatments (Mean±SD)

Figure 2.HE staining of cardiac tissue from each group (×200).图2各组大鼠心肌HE染色图

7 ELISA检测大鼠血清cTnI含量

与正常对照组比较，DM模型组血清的cTnI含量有不同程度的升高，模型组间存在差异，4周模型组比2周模型组更高(P＜0.05)，见图3。

8大鼠心肌组织cTnI蛋白的表达

Western blot实验结果表明2周、4周DM大鼠心肌中cTnI蛋白的表达相对于正常对照组明显增加(P＜0.01)，且4周DM大鼠cTnI蛋白表达的增加更显著(P＜0.01)，见图4。

讨论

心脏舒张功能降低是心功能降低的早期表现，之后伴随着心肌组织学改变［2］。在2型糖尿病模型中，8周之前心功能处于持续减低状态，心肌组织病理学及血清学也开始有改变。我们选取了糖尿病造模成功后4周之内的大鼠模型，研究cTnI血清学的改变，以期早期发现糖尿病心肌病。

Figure 3.The expression of cTnI in serum detected by ELISA.Mean±SD.n=9.＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05 vs 2-week DM.图3 ELISA检测大鼠血清cTnI含量

Figure 4.The expression of cTnI in cardiac tissue detected by Western blot.Mean±SD.n=9.＊＊P＜0.01 vs control;△△P＜0.01 vs 2-week DM.图4 Western blot检测大鼠心肌组织cTnI的表达

IR是2型糖尿病发病的重要始因，机体出现IR后，如果此时胰岛β细胞受损或功能不足，即导致2型糖尿病的发生［3］。本实验中高脂食物灌胃SD大鼠5周后，以30 mg/kg链脲佐菌素腹腔注射造模，3 d后测得大鼠血糖达到SD大鼠糖尿病标准(大于或等于11.1 mmol/L)，继而以DeFrono等建立的EICT法［4］测得糖尿病大鼠ISI明显低于对照组大鼠，表明糖尿病大鼠存在IR状态，造模成功。高血糖和脂肪酸浓度的升高为主要表现的代谢紊乱是2型糖尿病主要特征［5-6］。本研究显示，高脂模型条件下的DM模型，与正常对照组相比，DM大鼠血清TC、TG、LDL-C值有显著升高，并呈现持续的高血糖状态。Murfitt等［7］报道，早期糖尿病大鼠开始有心脏射血分数降低等左心功能性指标的改变，且已证实早期2型糖尿病大鼠模型存在心室舒张功能受损。本研究着重研究了2型糖尿病早期心肌改变，通过超声心动图评价早期糖尿病大鼠心肌结构及功能改变，结果显示，与正常对照组对比，模型组心肌呈现局部扩张，左室收缩及舒张功能指标都有所降低，尤其是左室舒张功能降低更显著，心肌室壁有增厚趋势，说明在糖尿病早期心肌在结构上已经发生局部改变，心功能也有降低趋势。测量2型糖尿病大鼠心脏及左心重量，并计算心体比、左心指数，发现糖尿病大鼠心体比及左心指数均高于对照组，提示糖尿病大鼠存在心脏肥大趋势。心肌组织病理可见糖尿病大鼠局部心肌细胞变性、坏死，亦说明糖尿病大鼠心肌细胞受到损伤。

cTnI是一种心肌细胞胞内酶，正常时这些酶分子量大不能透过细胞膜，因而在血清中活力很低。但在糖尿病应激状态下，心肌能量在短时间内激增，代谢增强，相应酶合成增加，心肌细胞胞内酶量增多［8］。cTnI为心肌特异抗原，具有高度的心肌特异性，对心肌损害高度敏感，并且由于目前为止其仅在心肌细胞中发现，而未在坏死心肌组织以外的任何其它部位发现，与骨骼肌亦无交叉反应性［9］。通过对糖尿病大鼠与正常对照组大鼠cTnI浓度的比较，我们得知糖尿病心肌病组cTnI浓度显著升高，4周DM组较2周DM组大鼠血清cTnI水平也显著增高，表明在糖尿病早期，cTnI的水平可能与心功能变化存在关联。cTnI主要存在于心肌的收缩部位，作为心肌受损标志物，对于心肌的损伤特别敏感，可以作为心肌微小损伤的早期标志。糖尿病心脏微血管病变也引起心肌结构损害，进一步引起心功能的变化，冠状动脉血流储备下降，心肌对缺血缺氧耐受阈值降低，内皮依赖的血管舒张功能受损。本研究采用超声心动图，对DM早期心功能相关指标分析也印证了这一点。同时微血管痉挛和再灌注损伤，引起心肌细胞受损，最终发展成为心肌病。本实验研究显示，DM血清cTnI浓度增高，说明已有心肌细胞受损。在DM早期，其血清浓度呈现递增趋势，此指标对于诊断早期糖尿病心肌病有意义。

糖尿病心肌病是糖尿病性心脏病的特异性病变，是糖尿病心血管严重并发症的重要组成部分，明确其发生发展过程中心肌相关指标的变化，进而做到早期诊断，成为研究热点。本实验揭示cTnI和心功能在早期DM心肌损伤中的变化趋势，我们将进一步研究其产生及调节机制，以期为糖尿病心肌病的早发现早治疗提供理论依据。

［参考文献］

［1］Ramachandran A，Snehalatha C.Epidemiology of heart disease in type 2 diabetes［J］.Medicographia，2007，29 (1) : 207-212.

［2］Voulgari C，Papadogiannis D，Tentolouris N.Diabetic cardiomyopathy: from the pathophysiology of the cardiac myocytes to current diagnosis and management strategies ［J］.Vasc Health Risk Manag，2010，6: 883-903.

［3］Kobayashi S，Liang QR.Autophagy and mitophagy in diabetic cardiomyopathy［J］.Biochimicaet Biophysica Acta，2015，1852(2) : 252-261.

［4］Francisco W，Mario NM，Camila LC，et al.Defective insulin signaling and mitochondrial dynamics in diabetic cardiomyopathy［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1853 (5) : 1113-1118.

［5］Sertoglu E，Kurt I，Tapan S，et al.Comparison of plasma and erythrocyte membrane fatty acid compositions in patients with end-stage renal disease and type 2 diabetes mellitus［J］.Chemi Physics Lipids，2014，178(2) : 11-17.

［6］Bai SZ，Sun J，Wu H，et al.Decrease in calcium-sensing receptor in the progress of diabetic cardiomyopathy［J］.Diabetes Res Clin Prac，2012，95(3) : 378-385.

［7］Murfitt L，Whiteley G，Iqbal MM，et al.Targeting caveolin-3 for the treatment of diabetic cardiomyopathy［J］.Pharmacol Ther，2015.151: 50-71.

［8］Asghar O，Al-Sunni A，Khavandi K，et al.Diabetic cardiomyopathy［J］.Clin Sci (Lond)，2009，116(10) : 741-760.

［9］Moriyama T，Kemi M，Okumura C，et al.Involvement of advanced glycation end-products，pentosidine and Nε-(carboxymethyl) lysine，in doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats［J］.Toxicology，2010，268(1-2) : 89-97.

(责任编辑:陈妙玲，余小慧)

Changes of heart function and serum cardiac troponin I in early type 2 diabetic rats

YIN Mao-shan1，2，XU Shu-hong3，MU Yan-ling2
(1School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250200，China;2Institute of Materia Medica，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China;3China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China.E-mail: myling501@hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the changes of heart function and the expression of serum cardiac troponin I (cT-nI) in early type 2 diabetic rats，and to explore the role of cTnI in the development of type 2 diabetes and early diabetic cardiomyopathy.METHODS: The type 2 diabetes rat model was established by an injection of streptozotocin after high fat diet (5 weeks).The rats were randomly divided into control group，model group of 2 weeks，and model group of 4 weeks.M-mode echocardiography was performed for echocardiographic measurements.Fasting blood glucose (FBG)，total cholesterol (TC)，triglyceride (TG)，high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)，low density lipoprotein-cholesterol (LDLC)，fasting insulin (FINS) and cTnI levels were tested.HE staining was used to observe the pathological changes of myocardial structures.The alteration of cTnI in myocardium was determined by Western blot.RESULTS: Compared with normal group，the levels of TC，TG and LDL-C in type 2 diabetic rats were significantly increased，HDL-C levels were significantly reduced.Cardiac histological analysis revealed that type 2 diabetes induced cardiomyocytes degeneration and necrosis.The expression of cTnI increased significantly in diabetic groups compared to control group，and that in model group of 4 weeks increased far more than that in model group of 2 weeks (P＜0.05).CONCLUSION: The increased level of cTnI and the change of the heart function may be associated with the development diabetic cardiomyopathy.These changes are valuable for the early clinical diagnosis of myocardial injury in diabetic cardiomyopathy.

［KEY WORDS］Cardiac troponin I; Heart function; Type 2 diabetes mellitus; Myocardial injury

通讯作者△Tel: 0531-82612443; E-mail: myling501@hotmail.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.30701022) ;山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划(No.BS2013SW008)

［收稿日期］2015-06-08［修回日期］2015-08-04

［文章编号］1000-4718(2015)09-1709-06

［中图分类号］R587.1; R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.032