OCT4、SOX2和NANOG在胆囊癌中的表达及临床意义

杨征宇，刘德纯

OCT4、SOX2和NANOG在胆囊癌中的表达及临床意义

杨征宇1，刘德纯2

目的 检测OCT4、SOX2和NANOG在胆囊癌组织和非癌胆囊黏膜中的表达，探讨其与胆囊癌临床病理之间的关系。方法 随机选取河南科技大学第三附属医院病理科2011年10月至2014年2月经外科手术切除且病理确诊的胆囊癌及良性胆囊病变组织标本各30例，应用免疫组化方法检测OCT4、SOX2和NANOG在胆囊癌及良性胆囊病变组织中的表达，分析其临床病理意义。结果 OCT、SOX2和NANOG蛋白在胆囊癌组织中阳性表达均明显高于其在非癌胆囊病变组织中的阳性表达，分别为(83.33% vs 23.33%；76.67% vs 20%；76.67% vs 20%)，以上各组组间差异均有统计学意义(P<0.05)。OCT4、SOX2和NANOG三者之间表达呈正相关关系(P<0.05)。结论 OCT4、SOX2和NANOG蛋白在胆囊癌组织中的异常表达说明其与胆囊癌的发生、发展有相关性，且OCT4、SOX2、NANOG表达与胆囊癌患者的临床分期及肿瘤的分化程度有关，而与患者的年龄、性别、肿瘤大小等因素无关，联合检测有助于明确肿瘤的生物学特性。

OCT4；SOX2；NANOG；胆囊癌；免疫组织化学

随着影像技术的快速发展及应用已经显著提高了胆囊癌的早期诊断率。并且随着分子生物学技术的高速发展，很多学者将一些肿瘤标志物用于胆囊癌的基础研究，研究胆囊癌的发生机制并试图寻找一些敏感度高、特异性强的肿瘤标志物用于胆囊癌的早期诊断。转录因子OCT4、SOX2和NANOG能够调节和维持成人和胚胎干细胞自我更新和多能性的调控因子，而且发现OCT4、SOX2和NANOG与多种肿瘤的发生发展存在着密切关系，OCT4、SOX2和NANOG作为多能干细胞标志物不仅在胚胎干细胞和生殖细胞中表达，而且在部分上皮肿瘤细胞中也有表达 ，被认为与多种恶性肿瘤的发生发展有密切关系，近年来逐渐成为研究热点[1]。本研究通过检测胆囊癌OCT4、SOX2、NANOG的表达，探讨其与胆囊癌临床病理之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 取自河南科技大学第三附属医院病理科2011年10月至2014年2月存档蜡块，经病理诊断明确的胆囊癌组织及良性病变组织标本，各收集30例，分实验组和对照组。其中胆囊癌组30例，男12例，女18例，平均年龄58.9岁(35～84岁)。肿瘤直径≥5 cm的17例，<5 cm的13例。组织学分型：高分化10例，中分化7例，低分化13例。有淋巴转移的19例，无淋巴转移的11例。实验所有患者术前都没有进行化学治疗、放射治疗和抗癌治疗，都有完整的临床资料。随机选取同期胆囊良性病变组织30例：其中慢性胆囊炎22例、胆囊息肉和腺瘤8例，作为对照组。

1.2 方法 免疫组化：应用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶染色法(SP法)分别检测胆囊癌和胆囊良性病变组织中OCT4、SOX2和NANOG蛋白的表达情况，按照SP试剂盒操作程序进行。即用型兔抗人OCT4多克隆抗体、即用型兔抗人SOX2多克隆抗体及即用型鼠抗人NANOG单克隆抗体，用试剂盒内已做好的阳性染色切片做阳性对照；用PBS代替一抗作阴性对照，其余操作两组间一致。结果由2名有经验的病理科医师独立双盲阅片并拍照, 每张切片均随机取5个视野，每个视野下均计数100个胆囊黏膜组织细胞，记录其中阳性细胞数，取百分数来计算细胞的阳性率。细胞质内呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。阳性细胞率(着色细胞数<5%记0分，<25%记1分，25%～50%记2分，50%～75%记3分，>75%记4分)。着色强度评分(未着色为0分；浅棕色颗粒为1分；棕黄色颗粒为2分；棕褐色颗粒为3分)。根据细胞染色强度和阳性细胞所占比例分别计分，两积分相加进行半定量判断实验结果，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性，3～4分为(+)，5-6分为(++)，7分为强阳性(+++)。

1.3 统计分析 统计学软件采用SPSS 19.0。两位观察者记录的结果采用Kappa分析，一致性用k值表示：<0.40表示一致性较差；0.41～0.75表示一致性中等；>0.75表示一致性很好。计数资料用χ2检验分析,指标阳性表达之间的相关性研究采用Spearman等级相关性分析，各检验方法皆以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OCT4、SOX2、NANOG的表达情况 OCT4蛋白在30例胆囊癌组织中阳性表达例数为25例，阳性率为：83.33%；在良性胆囊黏膜组织中阳性表达例数为7例，阳性率为23.33%(χ2=25.376，P=0.018)，两者差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。SOX2蛋白在30例胆囊癌组织中表达阳性例数为23例，阳性率为：76.67%；在良性胆囊黏膜组织中阳性例数为6例，阳性率为：20%(χ2=23.549，P=0.021)，两者差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表2。NANOG蛋白在30例胆囊癌组织中阳性表达26例，阳性表达率为86.67%。在胆囊良性病变组织对照组中阳性表达7例，阳性表达率为23.33%(χ2=26.539，P=0.019)，见图3、表3。本研究发现OCT4的阳性表达率随着SOX2、NANOG的升高而升高，三者之间呈正相关(rs=0.406，P<0.05)。

A：胆囊腺癌细胞胞浆中OCT4表达呈深染的棕褐色(SP,×400) B：慢性胆囊炎细胞胞浆OCT4阴性表达(SP,×400)

A：胆囊腺癌细胞胞浆SOX2表达呈棕褐色(SP,×400)； B：慢性胆囊炎细胞胞浆SOX2阴性表达(SP,×400)。

图2 SOX2在胆囊癌及胆囊良性病变组织中的表达情况

A：胆囊腺癌细胞胞浆NANOG表达呈棕褐色(SP,×400)； B：慢性胆囊炎细胞胞浆NANOG阴性表达(SP,×400)。

图3 NANOG在胆囊癌及胆囊良性病变组织中的表达情况

2.2 临床病理参数 OCT4、SOX2和NANOG蛋白的表达均位于胞浆中，均为阳性高表达，呈深染的棕褐色，而在良性胆囊病变中则未见表达，呈阴性，见图1～3。OCT4、SOX2和NANOG的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、CEA等均无统计学相关性(P>0.05)，而与肿瘤分化程度及有无淋巴转移有相关性(P<0.05)，尤其是与肿瘤的分化程度有显著的相关性(P<0.01)，见表4。

表4 OCT4、SOX2和NANOG在胆囊癌中的表达与临床病理特性的关系

3 讨论

OCT4因子是具有代表性的胚胎干细胞转录因子，是POU5F1基因编码产生的POU转录因子家族中的主要成员之一，又可称为POU5F1、Oct3、OTF4或者OTF3。人OCT4基因长度是16.40 kb，绝大多数在6号染色体上(6p21.31)，它可以从多个不同的起始位点转录出不同的mRNA亚型,最后翻译成不同的蛋白质[2-6]。转录因子SOX 基因家族在肿瘤中的相关功能被广泛关注，是一类具有高度保守HMG box DNA结合域的相关基因家族,编码SOX家族的转录因子, 参与多种发育过程的调控，如决定性别、神经发育、多种血细胞生成等多种组织器官发育，其中SOX2被认为是一种潜在的致癌因子。有研究表明SOX2具有干细胞调控的特性，是诱导多能干细胞的一个关键转录因子，而在肿瘤的发展中，肿瘤干细胞通过自我更新和增殖而形成肿瘤内各种癌细胞类型，是复发和转移的根源[7-8]。NANOG基因属于NK家族基因,是维持特殊结构域自我更新和多潜能性的重要调控因子, 在胚胎发育过程中能调控多能性内细胞团(ICM)的命运, 在维持外胚层多能性和阻止向原始内胚层分化中起着关键性的作用[9]。NANOG可能是通过控制与分化相关的转录因子如gata 4 和gata 6等的活性而保持特殊结构域的多潜能性[10-11]。OCT4、SOX2与NANOG等因子一同被看成是维持干细胞自我更新、无限增殖和多向分化潜能的重要因子,而且在维持干细胞生物特性中被认为是必需的，也被看成生殖细胞和干细胞的表面标志物[12-13]。

本研究结果显示，OCT4、SOX2、NANOG蛋白在人胆囊癌组织中的相对表达水平显著高于胆囊良性病变组织，提示在胆囊癌的发生及向恶性发展的过程与OCT4、SOX2、NANOG密切相关。

肿瘤中维持干细胞自我更新和增殖机制的一些调控因子的研究是肿瘤干细胞研究的重要内容，当前已发现胆囊癌干细胞的调控通路中有许多是参与干细胞自我更新和多能性维持的信号通路。OCT4、SOX2、NANOG在不同人体组织中的表达程度不尽相同，Northern Blotting实验结果表明OCT4、SOX2、NANOG广泛表达于多种人类组织中。而且OCT4、SOX2、NANOG在膀胱移行细胞癌、直结肠癌、乳腺癌、胃癌中呈现高表达，且与肿瘤的良恶性、侵袭转移能力及病人预后相关[14-17]。

本文研究发现，在OCT4高表达的胆囊癌组织中SOX2亦呈高表达，两者呈正相关关系。在另一项关于膀胱癌的研究中，NANOG作为能够专一识别位于核心组蛋白H2A、H2B上的特异性结合位点,并水解其上的泛素，而在核心组蛋白的去泛素化虽然不会致使组蛋白降解，但却能直接影响到DNA双螺旋结构的稳定，进而激发DNA 的复制转录，因此，NANOG有可能是整体激活转录的中枢调控分子[18]。而OCT4又被发现与癌基因 SOX2有着密切协同关系，是SOX2蛋白发挥生物活性的关键。因此，OCT4若发生高表达，则其功能发挥既在基因信息传递上游引发非正常的复制转录，又可在转录的关键过程中增强SOX2介导的靶基因转录，从而促使正常干细胞向肿瘤干细胞的进程，或直接促进正常细胞的向恶性转化，乃至增强恶性肿瘤细胞的浸润、转移能力，三者之间可能存在某种关系，相互抑制抑或相互协同，共同调节肿瘤细胞的增殖、分化及恶性转变等[19-22]。本研究中胆囊癌组织中OCT4、SOX2、NANOG表达水平显著升高，表明OCT4、SOX2、NANOG基因在胆囊癌发生、发展过程中有着重要的影响，若抑制OCT4、SOX2、NANOG基因的表达必定会诱发胆囊癌细胞生长抑制，促进其凋亡。既往的研究也已发现OCT4、SOX2、NANOG基因能够促进结肠癌细胞的增殖，这些都与本实验中的结论相符。

OCT4、SOX2、NANOG在胆囊癌中均呈过度表达，对照组中呈低表达或缺失，结果提示OCT4、SOX2、NANOG的过度表达能够促进肿瘤细胞的增殖，在胆囊癌发生、发展中起了重要作用。联合检测OCT4、SOX2、NANOG在胆囊癌中的表达能够进一步揭示胆囊癌的发生发展的可能机制。Spearman等级相关性分析结果显示，OCT4、SOX2、NANOG在胆囊癌中的表达呈正相关，提示三者均为阳性表达的胆囊癌细胞可能为肿瘤干细胞，本研究为肿瘤干细胞的分离提供了一定的依据。另外，本研究显示OCT4、SOX2、NANOG与肿瘤的分化程度、分期及有无淋巴结转移密切相关，而与年龄、性别、肿瘤大小及CEA水平无明显相关性。因此，OCT4、SOX2、NANOG能够反映胆囊癌的生物学特性，有可能作为胆囊癌诊断的肿瘤标志物或潜在预后的危险因素。

这些结果说明OCT4、SOX2和NANOG基因在癌细胞增殖过程中扮演着重要的角色，OCT4、SOX2和NANOG蛋白的过度表达可使原本处于静止状态的肿瘤细胞生长加速，诱导细胞恶变，使肿瘤易于发生发展。本研究为胆囊癌的分子靶向治疗提供了多个新的靶点，也为通过在分子水平上沉默OCT4、SOX2和NANOG基因的表达而抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡提供了良好的实验基础。

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Expression and Significance of OCT4，SOX2 and NANOG in Gallbladder Carcinoma

YANG Zheng-yu,LIU De-chun

(Third Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveThis paper aims to explore the correlation of OCT4，SOX2 and NANOG proteins and its relationship with clinical pathological features by detecting both the expressions of OCT4，SOX2 and NANOG proteins in gallbladder carcinoma.MethodsFrom the Third Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, we selected 30 surgical specimens of resected and pathologic diagnosed gallbladder carcinoma as an experimental group and selected 30 cases of benign lesions of gallbladder in the same period as a control group (from Oct. 2011 to Feb. 2014). Immunohistochemistry was used to detect the expressions of OCT4，SOX2 and NANOG proteins separately in gallbladder carcinoma and normal tissue, to explore the relationship between OCT4，SOX2 and NANOG proteins and gallbladder carcinoma, to analyze the relationship between OCT4，SOX2，NANOG proteins and clinical pathological features of gallbladder carcinoma.ResultsThe positive expressions of OCT4，SOX2 and NANOG proteins in gallbladder carcinoma are significantly higher than gallbladder benign lesions,the positive rate were that 83.33% vs 23.33% and 76.67% vs 20% and 76.67% vs 20%.There were statistically significant difference between the groups (P<0.05). Expression was positively correlated relationship between the OCT4，SOX2 and NANOG proteins(P<0.05).ConclusionIt is clear that positive expression of OCT4，SOX2 and NANOG proteins in gallbladder carcinoma is much higher than that in the control group of gallbladder benign lesions tissues, which shows that OCT4，SOX2 and NANOG proteins may play a certain role in the occurrence and development of gallbladder carcinoma.

OCT4；SOX2；NANOG；gallbladder carcinoma；immunohistochemistry

2015-01-09

1.河南科技大学第三附属医院普外一科，河南洛阳471003 2.河南科技大学第一附属医院普外科，河南洛阳 471003

杨征宇(1981-)，男，山西大同人，主治医师，从事普外科临床工作。

刘德纯，男，副主任医师，E-mail：liudechun2008@126.com

R735.8

A

1672-688X(2015)01-0004-05