响应面设计法优化软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取工艺

杜彦影,刘长江,刘旸旸

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

响应面设计法优化软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取工艺

杜彦影,刘长江*,刘旸旸

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

以软枣猕猴桃茎为原料,采用乙醇超声波提取法提取软枣猕猴桃茎中总生物碱并测定其含量。以乙醇体积分数、超声波时间、料液比3个单因素为自变量,以软枣猕猴桃总生物碱提取量为响应值,进行响应面实验。用酸性染料比色法测定软枣猕猴桃中总生物碱的含量,优化出软枣猕猴桃茎中总生物碱的最佳提取工艺。结果表明:软枣猕猴桃茎总生物碱的最佳提取工艺为:乙醇体积分数72%、超声时间30min、液料比为43倍。在此条件下,用紫外分光光度法测得软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取量为0.542mg/g。

软枣猕猴桃,总生物碱,响应面,提取工艺

为减少因修剪枝条造成的大量损失,从软枣猕猴桃茎中提取总生物碱是一个值得研究的课题。近年来,尚未发现有关软枣猕桃茎中生物碱提取工艺的报道,本实验首次研究从软枣猕猴桃茎中提取生物碱。由于生物碱易溶于有机溶剂,而超声波产生的振动作用加强了生物碱等物质的释放、扩散及溶解[12-13]。利用乙醇超声波辅助提取法进行软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取,采用酸性染料比色法测定总碱含量[14],并采用响应面法对其提取工艺进行优化[15-16],这对软枣猕猴桃的综合利用和功能性食品的开发提供了理论依据[17]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

软枣猕猴桃茎 沈阳农业大学野生软枣猕猴桃基地,该品种经辽宁省种子管理局鉴定并进行新品种备案,命名为长江1号;标准品乌头碱 中国药品生物制品鉴定所;无水乙醇、盐酸、氯仿、氨水、溴麝香草酚蓝、磷酸二氢钠、氢氧化钠 均为分析纯。

JY92-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;RE-52旋转蒸发仪、SHZ-D(III)循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;U-2910型紫外可见分光光度计 日立先端科技股份有限公司;中草药粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;PH计 德国赛多利斯股份公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 软枣猕猴桃茎总生物碱的制备 将软枣猕猴桃茎烘干、粉碎至粉末状,过60目筛子,准确称取软枣猕猴桃茎粉末5.0g置于烧杯中,加入95%乙醇浸泡24h,在超声波功率为200W的条件下提取30min,减压浓缩提取液至浸膏状,向浸膏中加入2%盐酸20mL酸化,静置,过滤,滤渣用2%的10mL盐酸清洗两次,滤液用30mL氯仿萃取3次,去除杂质,向滤液中加入浓氨水调节pH至10左右,再用等体积氯仿萃取3次,合并滤液,浓缩,用氯仿定容至25mL容量瓶中备用。

基于以上分析，未来我国智能电网的建设应从电源侧、电网侧、配用电侧和调度控制的智能化四个层面开展，如图3所示。

1.2.2 最大吸收波长的确定 采用酸性染料比色法,精密吸取样品溶液1mL,将其置于分液漏斗中,加入溴麝香草酚蓝缓冲液6mL,再加入氯仿6mL,充分振摇1min,静置30min,使氯仿和样品溶液充分分层,分取氯仿层,用脱脂棉除去水分,在200～600nm波长范围内进行紫外扫描[18]。取乌头碱标准品溶液1mL,方法同上进行测定;另取氯仿1mL,同法操作,所得氯仿溶液为空白溶液。结果表明,乌头碱标准品溶液和生物碱样品溶液的最大吸收峰均出现在415nm处,本实验选取415nm为最大吸收波长。

1.2.3 标准曲线的绘制 乌头碱标准品溶液的配制:精密称量乌头碱标准品3.5mg,置于50mL容量瓶中,用氯仿溶解并定容至刻度,即得质量浓度为0.07mg/mL的标准品溶液。

精密吸取配制好的标准品溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL,按1.2.2所述显色后,以1号为空白溶液,用紫外分光光度计分别在415nm处测定吸光度,纵坐标为吸光度(Y)、横坐标为乌头碱标准品质量浓度(X/(mg/mL)),绘制标准曲线,回归方程为:Y=5.7436x+0.0255,R2=0.9996。

1.2.4 软枣猕猴桃茎总生物碱的测定 精密吸取制备好的生物碱样品溶液1mL,测定吸光度,重复进行3次,取其平均值为吸光度。通过测得的吸光度,计算出对应的质量浓度,软枣猕猴桃茎总生物碱的计算公式为:

软枣猕猴桃茎总生物碱的提取量(mg/g)=C×V/M

方程式中:C为软枣猕猴桃茎总生物碱提取液的质量浓度(mg/mL);V为提取液定容的体积(mL);M为软枣猕猴桃粉末样品的质量(g)。

1.2.5 单因素实验 准确称取软枣猕猴桃茎粉末5g分别加入无水乙醇200mL浸泡,超声波提取30min,以总生物碱提取量为考察指标评价提取效果,分别考察乙醇体积分数、超声波时间、料液比、提取次数对总生物碱提取量的影响[19]。重复单因素实验3次,利用SPSS软件对数据进行分析。

1.2.6 响应面实验的设计 根据BOX-Behnken实验设计原理[20],选取对软枣猕猴桃茎中总生物碱提取率有显著影响的单因素乙醇体积分数、超声波时间、料液比为自变量设计响应面实验,考察提取总生物碱的最佳工艺条件。表1为实验因素水平编码。

表1 响应面实验因素水平设计表Table 1 Factors and levels of response surface test

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数的影响 不同的乙醇体积分数对总生物碱提取量的影响如图1。由图可知,当乙醇体积分数为80%时,生物碱的提取效果最好,当乙醇体积分数在20%～80%范围内,随着乙醇体积分数的增大,提取效果不断提高,而在超过80%后提取效果反而随乙醇体积分数增大而降低,原因可能是乙醇体积分数过大,软枣猕猴桃茎中其他有效成分溶解在提取液中,影响生物碱的提取效果。故选乙醇体积分数为80%。

图1 乙醇体积分数对总生物碱提取量的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on total alkaloids yield

2.1.2 超声波时间的影响 不同的超声波时间对总生物碱提取量的影响如图2。由图可知,在超声波时间为30min时,生物碱的提取效果最好,在30min之前,提取效果随超声时间呈上升趋势,但随着时间的延长,软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取效果明显下降,可能是因为生物碱在超声波的空化作用下,使生物碱的结构被破坏,从而导致生物碱的提取效果下降。故选超声时间为30min。

图2 超声波时间对总生物碱提取量的影响Fig.2 Effects of ultrasonic time on total alkaloids yield

2.1.3 液料比的影响 不同的液料比对总生物碱提取量的影响如图3。由图可知,随着溶剂量的不断增加,生物碱的提取效果呈显著增长的趋势,这可能是因为溶剂与浸提物接触充分,使溶出率增加,当液料比达到40倍时,生物碱的提取效果最好,随着溶剂量的继续增加,提取量略有下降,这可能是因为软枣猕猴桃茎中总生物碱的溶出已经达到饱和状态。为减少实验成本,故选择液料比为40倍。

图3 料液比对总生物碱提取量的影响Fig.3 Effects of liquid-solid ratio on total alkaloids yield

2.1.4 提取次数的影响 不同的提取次数对总生物碱提取量的影响如图4。由图可知,随着提取次数的增加,总生物碱提取量的变化并不明显。为了降低实验成本和节约时间,故选提取次数为2次。

图4 提取次数对总生物碱提取量的影响Fig.4 Effects of extract times on total alkaloids yield

2.2 响应面设计实验结果与分析

2.2.1 回归模型方程的建立及显著性检验 在单因素实验的基础上,利用响应面法对软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取工艺进行进一步优化。根据响应面法Box-Behnken设计,共对17个实验点进行实验,软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取量见表2。

利用Design-Expert.8.05b软件进行分析,以软枣猕猴桃总生物碱的提取量为响应值,得到软枣猕猴桃茎中总生物碱的提取量(Y)对乙醇体积分数(A)、超声波时间(B)、液料比(C)的二次多项式回归模型方程为:Y=0.54-0.030A-0.025B+0.025C-2.500E-003AB-0.043AC+0.052BC-0.056A2-0.061B2-0.056C2。模型系数显著性结果和方差分析结果见表3。

表2 软枣猕猴桃茎总生物碱响应面分析方案及实验结果Table 2 Test design and results of response surface analysis of Actinidia arguta stems

由表3知,乙醇体积分数一次项、乙醇体积分数与液料比的交互项、超声波时间与液料比的交互项、乙醇体积分数的二次项、超声波时间的二次项和液料比的二次项达到极显著水平(p<0.0001)。超声波时间的一次项和液料比的一次项达到显著水平(p<0.05)。乙醇体积分数与超声波时间的交互项不显著(p>0.05)。结果表明,各变量因素对总生物碱提取效果的影响不是简单的线性关系。

2.2.2 响应面分析与优化 利用软件Design-Expert 8.05b对表2数据进行二次回归多元拟合,得到的二次回归方程的响应面,见图5～图7。

表3 回归统计分析表Table 3 Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

注:**：差异极显著,p<0.0001;*：差异显著,p<0.05。

由图5可知,响应面图形表示了乙醇体积分数(A)与超声波时间(B)交互作用的3D图,从响应面的最高点可以看到,在所选范围内存在最大值。响应面的等高线可以看出各因素对响应值的影响程度,响应面曲面坡度的陡峭度可以看出各因素交互作用的强弱。当液料比固定在43倍时,当乙醇体积分数为70%左右时,超声波时间为30min附近时,总生物碱提取量达到最大值。由响应面图形可以观察到,等高线的形状偏圆形,表明乙醇体积分数(A)和超声波时间(B)交互作用不显著。

图5 乙醇体积分数与超声波时间对总生物碱提取量的影响Fig.5 Effect of volume fraction of ethanol and ultrasonic time on extract yield of total alkaloids

由图6可知,响应面图形表示了乙醇体积分数(A)与液料比(C)交互作用的3D图。当超声波时间固定在30min时,乙醇体积分数为70%,料液比在40倍时,总生物碱的提取效果最佳。由响应面图形可以观察到,等高线的形状偏椭圆形,表明乙醇体积分数(A)和超声波时间(C)交互作用显著。

图6 乙醇体积分数与液料比对总生物碱提取量影响Fig.6 Effect of volume fraction of ethanol and solid-liquid ratio on extract yield of total alkaloids

由图7可知,响应面图形表示了乙醇体积分数(B)与液料比(C)交互作用的3D图。当乙醇体积分数固定在72%时,当超声波时间短,液料比低时,总生物碱提取效果不好,随着超声时间的增加和液料比的增大,总生物碱的提取效果增大,当超声波时间为30min,液料比为43倍时,总生物碱的提取率达到最高。由响应面图形可以观察到,等高线呈椭圆形,超声波时间和液料比的相互作用显著。

图7 超声时间与液料比对总生物碱提取量影响Fig.7 Effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on extract yield of total alkaloids

利用Design-Expert8.05b软件分析可知,得到软枣猕猴桃茎总生物碱的最佳工艺条件为乙醇体积分数为72.03%,超声波时间为29.32min,液料比为43.43倍。在此条件下,得到软枣猕猴桃总生物碱提取量的理想值为0.550939mg/g。为了方便实验操作,我们选择的实验条件为:乙醇体积分数为72%,超声波时间为30min,液料比为43倍,得到的总生物碱提取量的实际值为0.542mg/g。这与理论值十分相近,因此,可以采用响应面法优化软枣猕猴茎总生物碱的提取工艺。

3 结论

在软枣猕猴桃茎总生物碱提取的工艺中,乙醇体积分数、超声波时间和液料比对总生物碱提取量都有一定的影响。通过单因素实验和响应曲面分析法,以总生物碱提取量为指标,确定了最佳提取工艺为:乙醇体积分数为72%、超声时间为30min和液料比为43倍,在此条件下测得软枣猕猴桃总生物碱的实际值为0.542mg/g。

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Optimization of total alkaloids extraction fromActinidiaargutastems using response surface methodology

DU Yan-ying,LIU Chang-jiang*,LIU Yang-yang

(College Food Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

The total alkaloids fromActinidiaargutastems were extracted and measured using the method of ultrasonic extraction with ethanol as extraction solvent. Response surface methodology was taken to optimize the extraction of total alkaloids inActinidiaargutastems. Three elements including ethanol concentration,ultrasonic time and solid-liquid ratio were selected to maximize the yield of total alkaloids. Furthermore,the optimal extraction conditions of total alkaloids fromActinidiaargutastems were 72% ethanol,ultrasonic treatment time 30min,liquid-solid ratio 43. Under these conditions,the content of total alkaloids was 0.542mg/g fromActinidiaargutastems by ultraviolet spectrophotometer.

Actinidiaargutastem;total alkaloids;response surface methodology;extraction

2014-09-22

杜彦影(1989-),女,硕士,研究方向:食品生物技术。

*通讯作者:刘长江(1955-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技术。

农业部公益性行业(农业)科研专项(200903013)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)13-0220-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.038